Nuevos mecanismos implicados en la regulación de los niveles de antitrombina

Abstract

La inhibición de un gran número de serín proteasas procoagulantes que realiza la antitrombina, junto con su eficaz mecanismo, la convierte en el principal anticoagulante endógeno. Debido a ello, la reducción, incluso moderada, de la actividad anticoagulante de la antitrombina incrementa de manera significativa el riesgo trombótico y su deficiencia completa causa letalidad embrionaria. El análisis de casos con deficiencia de antitrombina ha permitido identificar alteraciones genéticas que afectan los niveles o la función de este anticoagulante. Estos estudios también han contribuido a conocer dominios funcionales y estructurales, y han permitido el desarrollo de terapias anticoagulantes. Sin embargo, son escasos los estudios que hayan evaluado elementos reguladores de los niveles de antitrombina o responsables de la variabilidad de formas de antitrombina detectadas en plasma. Aún se desconoce, por ejemplo, la localización del promotor del propio gen, así como elementos potenciadores o silenciadores de la transcripción del mismo y se piensa que todas las variantes genéticas ocasionan una sola variante proteica. Empleando tres estrategias diferentes, y aplicando diferente metodología (molecular, bioquímica, funcional) en distintos modelos (pacientes, sistemas celulares y modelos animales), este proyecto doctoral ha buscado aportar nueva información sobre esta molécula. En primer lugar, estudiamos 30 pacientes con deficiencia de antitrombina que sin embargo no presentaban alteraciones en las regiones codificantes de SERPINC1 ni en genes implicados en la ruta de la N-glicosilación. Cuatro de estos pacientes presentaban alteraciones que afectaban 2 de las 6 secuencias VDRE identificadas en el gen. Estudios de validación familiar y en 307 sujetos sanos confirmaron el efecto funcional para las tres alteraciones donde estos estudios pudieron realizarse, y demostraron que estas modificaciones reducen ligera, pero significativamente, los niveles de antitrombina en plasma. Este apartado se complementó con la demostración en un modelo celular (HepG2) del efecto positivo y dependiente de dosis, que la vitamina D tiene sobre los niveles de ARNm y proteína sintetizada y secretada. En un segundo capítulo, analizamos 3 pacientes incluidos en un programa de trasplante hepático por atresia biliar que sorprendentemente presentaban niveles inusualmente elevados de antitrombina (150-190%). Tras comprobar que el incremento no era ningún artefacto y se correspondía con un aumento específico de la proteína circulante, analizamos los posibles elementos implicados en el aumento específico de antitrombina. Como en estos pacientes se acumulan sales biliares, y dado que éstas pueden ejercer una función reguladora transcripcional, analizamos en un modelo celular las consecuencias transcripcionales de 4 de ellas (CA, CDCA, UDCA y LCA). El CDCA incrementaba significativamente y de forma dosis dependiente los niveles de ARNm de SERPINC1. Este efecto se validó en dos modelos murinos, ratones silvestres y ratones con deficiencia heterocigota de antitrombina. En el modelo empleando ratones deficientes en antitrombina, la administración de 25 mg/kg de CDCA aumentaba los niveles de ARNm y proteína plasmática a valores similares a los encontrados en ratones silvestres, mostrando las posibilidades terapéuticas de estos elementos reguladores. Finalmente realizamos un profundo estudio de la mutación p.Arg393Cys, previamente descrita en casos con deficiencia de antitrombina tipo II con defecto del centro reactivo. Efectivamente, la mutación del residuo P1 de la antitrombina (Cys393) provoca una pérdida de función. Pero sorprendentemente, el estudio de la antitrombina plasmática de estos pacientes, empleando diferentes condiciones electroforéticas, permitió comprobar que la mutación generaba dos tipos de formas variantes: una que interacciona mediante puentes disulfuro con la albúmina y una forma variante monomérica. El calentamiento del plasma de portadores a temperaturas ligeramente moderadas (40˚C durante 24h) provocaba la transición de la forma monomérica a la dimérica, pero como esta interacción se producía en el plasma,no podía llevar implícito la formación de un puente disulfuro, como comprobamos tras la purificación de los complejos del plasma y su análisis posterior. De esta forma, mostramos que una misma alteración genética puede generar heterogeneidad de formas variantes. Finalmente, especulamos sobre el posible papel, que el balance de estas formas pudiera tener, en el desarrollo de eventos trombóticos. En conclusión, nuestro estudio muestra nuevos elementos implicados en el control de los niveles y plegamiento del anticoagulante endógeno más importante. Alteraciones en los elementos de regulación del gen SERPINC1, como el eje RXR/VDR descrito en este estudio; cambios en las concentraciones de factores que regulen al gen como las ácidos biliares; y condiciones externas que puedan modificar el balance de formas diferentes de antitrombinas variantes, pueden afectar a los niveles o función de la antitrombina. Estos resultados tienen relevancia en la caracterización molecular de la deficiencia de antitrombina, en la identificación de factores con importancia pronóstica, y pueden tener aplicaciones terapéuticas.

The essential role of antithrombin as a crucial endogenous anticoagulant is defined by the large number of procoagulant proteases that this serpin inhibits by a strong and efficient mechanism, and by the dramatic consequences of its deficiency. We know that even moderate deficiency of antithrombin significantly increases the risk of thrombosis and homozygous deficiency is lethal. The analysis of patients with deficiency of antithrombin has helped to identify defects in SERPINC1, the coding gene, which affect the levels or function of this key anticoagulant. These studies have also assisted to characterize functional or structural domains and they have allowed the development of anticoagulant therapies. However, it surprises the few studies evaluating other elements playing a role in the regulatory mechanism of such a crucial molecule. Additionally, only few studies have evaluated patients or states with high antithrombin levels. Unfortunately, the promoter region of this gene is largely not known and few studies have identified regions potentially involved in the transcriptional regulation of this gene. Finally, there are few examples of a variability of antithrombin variants caused by a single mutation and the pathological consequences of such variability. In this thesis, we tried to discover new information concerning potential regulatory mechanisms of antithrombin. This was achieved by using variable methodology (molecular, biochemical, functional) in different models (patients, cell lines and animal). The analysis of potential regulatory regions of SERPINC1 in patients with antithrombin deficiency but without known genetic defects is an excellent strategy to identify new regulatory elements of SERPINC1 and mechanisms involved in the regulation of antithrombin. Moreover, this approach may potentially reveal new thrombotic risk factors. First of all, we have addressed this issue through the study of a cohort of 30 patients with moderate or severe deficiency of antithrombin without mutation in the coding region of the SERPINC1 gene. Four of these patients carried regulatory mutations. These mutations disrupt two out of six potential vitamin D receptor elements (VDRE) identified in SERPINC1. The functional effects of these gene variations were validated by family studies as well by their analysis in a control cohort of 307 Spanish Caucasian healthy blood donors. The relevance of the vitamin D pathway on the regulation of SERPINC1 was confirmed in a cell model. The treatment of HepG2 with the vitamin D analog, paricalcitol, increased the levels of expression of SERPINC1 mRNA dose dependently. The increased transcriptional rate paralleled with augmented levels of antithrombin secreted to the conditioned medium. In the second chapter, we have studied three unrelated patients included on the waiting list for liver transplantation due to hepatic damage caused by biliary atresia and reported to our laboratory because of abnormally higher antithrombin levels (anti-FXa: 150-190%).We confirmed theses abnormal levels by different methods, functional and different immunological approaches, discarding any potential artifact. Interestingly, all the three patients shared the same disorder underlying the hepatopathy, biliary atresia, and they received ursodeoxycholic acid therapy, a nonhepatotoxic bile salt. We speculated that the accumulation of bile salts in liver of these patients might play a role in the abnormally high levels of antithrombin identified. Bile salts are also potent regulators of gene transcription. Accordingly, we tested in a cell model the effects of four bile salts (CDCA, CA, LCA, UDCA) on SERPINC1. Only CDCA significantly increased the levels of SERPINC1 transcripts. To prove the hypothesis that bile salts could play a potential role in the antithrombin level we evaluated this modulator on two animal models (wild type and serpinc1+/- deficient). The results observed, strongly support that CDCA at a dose of 25 mg/Kg increases two fold the expression of this gene also in vivo. Actually, this effect is able to normalize the levels of RNAm levels of this gene in mice with heterozygous antithrombin deficiency. Finally, we made a deep analysis of the SERPINC1 p.Arg393Cys mutation, which has been previously reported as an antithrombin deficiency type II RCL. In fact, this mutation, byaffecting the P1 residue of the reactive center loop causes a loss-of -function. Surprisingly, analysis of plasma antithrombin of carriers by native-PAGE revealed two different variants: one forming a dimer with albumin interacting by disulphide bonds and another monomeric variant. Interestingly, moderate heating of plasma samples (40 ˚C for 24h) induced the transformation of the monomeric variant into a dimer form. As disulphide linkage takes place intracelullarly, the complex generated in these conditions is not linked by disulphide bonds, as we demonstrated by analysis of the complexes purified by chromatography. Thus, our study demonstrates that the same mutation produces different variants whose levels may change according to the environmental conditions. We speculate that transformation to the dimer variant might have deleterious consequences and might increase the risk of thrombosis. In conclusion, our study shows new agents involved in the control of levels and folding of the most important endogenous anticoagulant. Changes in regulatory elements of SERPINC1 gene: the RXR/VDR described before, different concentration in factors that modulate the gene as bile salts; as well as external conditions able to disturb the balance of types of antithrombin variants, could affect the levels and function of antithrombin. The results obtained in this thesis may help to achieve a better molecular characterization of antithrombin deficiency, may be useful to define the prognosis, and could also have potential therapeutic application, growing the antithrombotic arsenal.