Desarrollo y validación de un método para el análisis de opiáceos y cocaína en tejido óseo humano

Abstract

La utilización en Medicina Legal y Forense del hueso como matriz para análisis toxicológicos, ha sido investigada ampliamente desde el año 2000, dando lugar en un período relativamente corto de tiempo, a una expansión significativa del número de compuestos detectados en dicho tejido. Aunque se han descrito estudios empleando tejido óseo humano post-mortem, principalmente se han desarrollado investigaciones con animales de experimentación bajo condiciones controladas de dosis, vía de administración, patrones de exposición a la sustancia, tiempo transcurrido entre la última administración y la muerte, grado de descomposición, etc. En estos estudios, se han analizado diferentes tipos de tejido óseo y se han empleado una variedad de métodos de extracción de las sustancias de la matriz ósea, como la extracción líquido-líquido, en fase sólida o asistida por microondas, así como diferentes métodos de análisis y detección (ELISA, ELISA-LC-MS, UPLC-MS, GC-MS, etc.). A pesar de la gran progresión en el estudio del hueso como matriz toxicológica en los últimos años, no existen protocolos estandarizados para la extracción y cuantificación de sustancias en esta matriz en humanos. Es importante destacar que, entre las distintas sustancias de abuso existentes, los opiáceos y la cocaína constituyen un grupo de gran interés médico-legal ya que se trata de drogas de una elevada prevalencia de consumo y responsables de la mayor parte de daños agudos relacionados con drogas. Los opiáceos son las drogas que mayor número de sobredosis generan, mientras que las muertes producidas por cocaína han aumentado en los últimos años, aunque muchas de estas muertes parecen ser realmente sobredosis por heroína en personas que también consumían cocaína. Por tanto, el propósito de este estudio es desarrollar y validar un método para el análisis de opiáceos y cocaína en hueso humano de manera simultánea. Para demostrar la fiabilidad y robustez del método y para investigar de forma preliminar la relación entre las concentraciones óseas y sanguíneas, el método se aplicará a muestras óseas de pacientes fallecidos cuyo análisis toxicológico para estas sustancias de abuso en sangre fue positivo. Se recogieron fragmentos costales de 100 cadáveres autopsiados en el Instituto de Medicina Legal de Murcia. Las muestras óseas fueron desecadas, pulverizadas, e incubadas con acetonitrilo en un baño de ultrasonidos. La solución resultante fue sometida a una extracción en fase sólida y para el análisis se empleó la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas. El método fue validado en el rango de concentraciones de 0,3-1 ng/mg (dependiendo de la sustancia) a 150 ng/mg, las recuperaciones absolutas medias oscilaron entre el 66% y el 110%, el efecto de la matriz del 62% al 121% y la eficiencia del proceso de 61% a 89% dependiendo del analito. Los valores de precisión intra e inter-ensayo fueron en todos los casos mejores de 20%. El método validado se aplicó con éxito a muestras óseas humanas extraídas de 6 cadáveres cuyo análisis toxicológico en sangre para las sustancias en estudio fue positivo. Las sustancias fueron detectadas en hueso en 12 de los 15 resultados positivos en sangre. El rango de concentración aproximado fue de 3 a 5 ng/g para 6-monoacetilmorfina, 3 a 7 ng/g para morfina, 14 a 28 ng/g para metadona y 6 ng/g y 11 ng/g para tramadol y benzoilecgonina.

In recent years, a great advance has occurred in the study of bones as toxicological matrix, resulting in a wide range of substances analysed in this tissue. Some of these studies have been developed in humans, but most of the researchers use experimental animals under controlled conditions of dose, route of administration, delay between administration and death, degree of decomposition, etc. These studies have examined several conditions that may influence on toxicological measurements in bone such as the patterns of drug exposure or the delay between the last exposure and death. Furthermore, a variety of different skeletal tissues have been analysed, and a number of different methods for tissue treatment (microwave-assisted extraction or SPE) and analyte detection (ELISA, ELISA-LC-MS, UPLC-MS, GC-MS) have been tested. Despite the advances made in the study of bone as toxicological matrix in recent years, there are no standardized protocols for the extraction and quantification of drugs from this matrix in human. Opioids and cocaine are drugs of great medical-legal interest, since both are usually involved in acute drug-related damage. Cocaine is widely consumed and deaths involving it have increased, although many of these may be due to heroin overdoses among people who also used cocaine since opioids frequently generate fatal poisonings. Therefore, this study aims to develop and to validate a fast method for simultaneous analysis of the following substances in human bone: 6-monoacetylmorphine, morphine, cocaine, benzoylecgonine, tramadol and methadone. We applied the methodology to real forensic cases whose toxicological analysis for these drugs in blood was positive to check the reliability and robustness of the method and to investigate preliminarly the relationship between bone and blood concentrations. Bone fragments were taken from 100 cadavers autopsied in the Institute of Legal Medicine of Murcia. Samples were dried, pulverized, and incubated in acetonitrile under ultrasounds. Then, samples were subjected to a solid phase extraction and the analysis was performed by gas chromatography–mass spectrometry. The assay was validated in the range 0.3-1 ng/mg (depending on the drug) to 150 ng/mg, the mean absolute recoveries ranging from 66% to 110%, the matrix effect from 62% to 121% and process efficiency from 61% to 89% depending on the analyte. The intra- and inter-assay accuracy values were always better than 20%. The validated method was then successfully applied to real bone samples from six forensic cases in which toxicological analysis for these drugs in blood was positive. Drugs were detected in bone in 12 of the 15 blood positive results. The approximate concentration range was 3–5 ng/g for 6-monoacetylmorphine, 3–7 ng/g for morphine, 14-28 ng/g for methadone and 6 ng/g and 11 ng/g for tramadol and benzoylecgonine.