Tipificación molecular y mecanismos de resistencia antimicrobiana en micoplasmas asociados a la agalaxia contagiosa

Abstract

La presente tesis doctoral se ha realizado en formato de compendio de publicaciones y los artículos que la conforman tienen el objetivo común de evaluar distintas técnicas disponibles para la detección de M. agalactiae en muestras de leche de cabra, así como la tipificación molecular de las cepas circulantes y los mecanismos de resistencia antimicrobiana de las micoplasmas causantes de la agalaxia contagiosa. De esta forma, los objetivos específicos y la metodología seguida fueron: 1) Evaluar los límites de detección de las técnicas de cultivo microbiológico y PCR empleadas para la detección de M. agalactiae en muestras de leche de cabra inoculadas experimentalmente; 2) Determinar la concordancia entre las técnicas de cultivo microbiológico y PCR utilizadas para detectar M. agalactiae en muestras de mamitis procedentes de rebaños caprinos crónicamente infectados; 3) Evaluar la variabilidad genética de cepas de campo de M. mycoides subsp. capri y M. capricolum subsp. capricolum con diferentes características epidemiológicas procedentes de áreas endémicas de agalaxia contagiosa; 4) Evaluar la susceptibilidad in vitro a diferentes antimicrobianos de cepas de M. capricolum subsp. capricolum aisladas en España e Italia y 5) Estudiar la importancia de los genes de la región QRDR en el aumento de la resistencia a quinolonas así como determinar las mutaciones específicas que nos aportan información acerca de la susceptibilidad a quinolonas de las cepas de M. agalactiae y M. capricolum subsp. capricolum. Los resultados obtenidos permiten concluir que: 1) En muestras de leche de cabra, la técnica del cultivo microbiológico presenta un límite de detección de M. agalactiae inferior al obtenido por la PCR. Por lo tanto, en muestras de leche de tanque se recomienda la realización del diagnóstico mediante cultivo, mientras que en muestras de mamitis clínicas ambas técnicas presentan una buena concordancia; 2) Los esquemas de MLST son una herramienta útil para la detección de diferencias genéticas entre aislamientos de M. mycoides subsp. capri procedentes de distintos orígenes geográficos. Asimismo, esta técnica permite detectar diferencias entre cepas presentes en un mismo rebaño al mismo tiempo; 3) M. mycoides subsp. capri y M. capricolum subsp. capricolum presentan una gran variabilidad genética entre cepas aisladas en una misma área endémica de agalaxia contagiosa, mayor que la observada anteriormente en otras especies de micoplasmas como M. agalactiae; 4) No existe una relación directa entre la evolución filogenética de las cepas de M. capricolum subsp. capricolum y sus perfiles de susceptibilidad a distintos antimicrobianos; 5) La doxiciclina es el antimicrobiano más eficaz para inhibir el crecimiento de las cepas estudiadas de M. capricolum subsp. capricolum. Asimismo, algunos de los aislamientos analizados resultaron ser resistentes a quinolonas y macrólidos; 6) El aumento de la resistencia a quinolonas en M. capricolum subsp. capricolum y M. agalactiae se debe a la aparición de mutaciones en los genes que codifican la DNA girasa y la topoisomerasa IV bacterianas y 7) El gen parC es el que aporta mayor información acerca de la susceptibilidad a quinolonas de M. capricolum subsp. capricolum y M. agalactiae.

This doctoral thesis is presented as a compendium of publications and the articles that form part of it have the common goal of evaluate different diagnostic techniques for the detection of M. agalactiae in goat milk samples and the characterization of field isolates of contagious agalactia causing mycoplasmas by molecular typing and the study of their antimicrobial resistance mechanisms. Thus, the specific objectives and methods were: 1) To determine the lower M. agalactiae detection limits of culture and PCR techniques in experimentally inoculated goat milk samples, 2) To establish the agreement between PCR and culture techniques for the detection of M. agalactiae using mastitic milk samples retrieved from chronically infected commercial dairy herds, 3) To assess the genetic variability of different M. mycoides subsp. capri and M. capricolum subsp. capricolum field isolates with different epidemiological characteristics isolated from contagious agalactia endemic areas, 4) To evaluate the in vitro antimicrobial susceptibility of M. capricolum subsp. capricolum field isolates retrieved from Spain and Italy and 5) To study the importance of the QRDR in the acquisition of quinolone resistance, determining the specific genes that provide useful information about quinolone resistance in M. agalactiae and M. capricolum subsp. capricolum isolates. The obtained results allowed us to conclude: 1) In goat milk samples, bacterial culture technique has a lower detection limit of M. agalactiae than PCR. Therefore, culture is recommended when bulk tank milk samples are analyzed, whereas both techniques have a good agreement when detecting this pathogen in mastitic milk samples; 2) MLST schemes are a useful tool to detect genetic differences between different M. mycoides subsp. capri field isolates coming from different geographical areas. Moreover, they also allow the detection of variations between isolates retrieved from the same herd at the same time; 3) M. mycoides subsp. capri and M. capricolum subsp. capricolum show great genetic variability between field isolates coming from the same contagious agalactia endemic area. These differences are greater than those reported in other mycoplasma species such as M. agalactiae; 4) There is no connection between phylogeny and antimicrobial susceptibility in the studied M. capricolum subsp. capricolum strains; 5) Doxycycline is the most effective antimicrobial inhibiting M. capricolum subsp. capricolum growth. Besides, some of the analyzed field isolates were resistant to quinolones and macrolides; 6) The acquisition of quinolone resistance in M. capricolum subsp. capricolum and M. agalactiae is due to mutations in the genes that encode enzymes DNA gyrase and topoisomerase IV and 7) parC is the gene providing most information about quinolone susceptibility in M. capricolum subsp. capricolum and M. agalactiae.