Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/65142

Title: Influencia de la penicilina y de las hormonas sexuales 17 beta-estradiol y progesterona sobre la infección por Chlamydia abortus en líneas celulares de endometrio y trofoblasto de origen ovino
Issue Date: 7-Dec-2018
Date of creation: 28-Nov-2018
Publisher: Universidad de Murcia
Related subjects: CDU::6 - Ciencias aplicadas::63 - Agricultura. Silvicultura. Zootecnia. Caza. Pesca::636 - Veterinaria. Explotación y cría de animales. Cría del ganado y de animales domésticos
Keywords: Patología veterinaria
Abstract: Chlamydia abortus es un patógeno intracelular obligado que causa abortos al final de la gestación en pequeños rumiantes. En ovejas no gestantes, el microorganismo puede establecer una infección latente o subclínica hasta que se produce la gestación, momento en el cual se reactiva, invade la placenta y produce el aborto. Los mecanismos concretos que desencadenan la reactivación de C. abortus no se conocen en la actualidad. Estudios previos sugieren que las fluctuaciones de las hormonas que regulan los ciclos reproductivos en ovejas, en concreto el estradiol (E2) y la progesterona (P4) pueden estar asociadas con la reactivación de C. abortus. Sin embargo, esta asociación no se ha estudiado hasta ahora. Los objetivos de esta tesis son: (i) evaluar la influencia de la penicilina y del E2 y la P4 en el crecimiento de C. abortus in vitro; (ii) analizar la ultraestructura de inclusiones clamidiales desarrolladas en distintas líneas celulares y expuestas a penicilina, E2 o P4, y (iii) estudiar cambios en la respuesta transcripcional de C. abortus cultivada en distintas líneas celulares y expuesta a penicilina, E2 o P4. Los experimentos se llevaron a cabo sobre dos líneas celulares de origen ovino: la línea AH-1, procedente de trofoblasto y la línea LE, de epitelio endometrial. Los cultivos fueron tratados con penicilina, E2 o P4 antes de ser infectados con C. abortus. Utilizamos técnicas de inmunofluorescencia indirecta para determinar el número, tamaño y forma de las inclusiones intracitoplasmáticas en los distintos cultivos; además, realizamos aislamiento de cuerpos elementales a partir de los sobrenadantes de los cultivos, y finalmente se recogieron las células infectadas de cada cultivo para determinar la cantidad de ADN clamidial por q-PCR. Para evaluar el efecto de la penicilina y las hormonas en la ultraestructura de las inclusiones se recogieron pellets celulares a las 72 horas post-infección (hpi) y se observaron por MET. Los cambios transcripcionales de C. abortus ante los tratamientos fueron estudiados a partir del ARNm de células infectadas y recogidas a las 48 y 72 hpi. Se analizaron 16 genes relacionados con el ciclo de desarrollo clamidial mediante q-PCR. En general, las hormonas sexuales E2 y P4 aumentaron la infectividad de las células AH-1 y LE, mientras que la penicilina produjo el efecto contrario. Los cultivos de C. abortus tratados con penicilina mostraron, por primera vez en esta especie, características típicas del estado de persistencia como la aparición de inclusiones de pequeño tamaño que contenían cuerpos reticulares anormalmente grandes y un perfil de genes caracterizado por una regulación al alza de genes relacionados con la respuesta a estrés y una regulación a la baja de genes relacionados con la síntesis de proteínas de membrana y división celular, en ambas líneas celulares y momentos post-infección estudiados. Los genes omcA y omcB (proteínas de membrana), dnaK (respuesta a estrés) y hctA (conversión de CR a CE) se proponen como indicadores del estado de persistencia in vitro inducido por penicilina en Chlamydia abortus. Por otra parte, la suplementación del medio con hormonas produjo diferentes resultados en función de la línea celular utilizada, lo que sugiere que los efectos de las hormonas en el desarrollo del ciclo clamidial se producen de forma indirecta, a través de alteraciones en el ambiente de la célula hospedadora. Además, la progesterona y, en menor medida el 17β-estradiol, indujeron la aparición de formas aberrantes en cultivos de células LE, aunque este hecho no se asoció con alteraciones en los genes estudiados en Chlamydia abortus. Por tanto, no su pudo establecer un patrón común de expresión de genes que sea válido para distintos sistemas de inducción de persistencia clamidial. Chlamydia abortus is an obligate intracellular pathogen with affinity for placental tissues that causes reproductive failure in sheep and goats worldwide. In non-pregnant sheep, the organism can establish a latent or sub-clinical infection until the subsequent gestation, when it reactivates, invades the placenta and induces abortion. The precise mechanisms that trigger the awakening of C. abortus are still unknown. Previous studies suggest that fluctuations in hormones that regulate reproductive cycles in sheep, especially estradiol (E2) and progesterone (P4), might be associated with the reactivation of C. abortus. However, this association is poorly understood. The objectives of this PhD thesis are therefore: (i) to assess the influence of penicillin, E2 and P4 on the growth of C. abortus in vitro; (ii) to analyse the morphology of chlamydial inclusions grown in different cell lines and exposed to E2, P4 or penicillin, and (iii) to examine changes in the transcriptional response of C. abortus cultured in different cell lines and exposed to E2, P4 or penicillin. Experiments were carried out using two ovine cell lines: the trophoblast cell line AH-1 and the endometrial cell line LE. Cells were exposed to E2, P4 or penicillin prior to experimental infection with C. abortus. To study the influence of hormones and penicillin on the growth and development of C. abortus, we first performed an indirect immunofluorescence technique to assess the number and shape of inclusions in the different cultures. Then, we used supernatants to carry out the isolation and counting of viable free elementary bodies. Finally we collected cell monolayers to determine the amount of chlamydial DNA by q-PCR. To assess the effect of hormones and penicillin on the ultrastructure of inclusions, cell pellets were collected at 72 hours post-infection (hpi) and examined by transmission electron microscopy (TEM). Chlamydial transcriptional changes were studied from infected cells harvested at 48 and 72 hpi. mRNA expression analysis of 16 genes related to the chlamydial developmental cycle was carried out by q-PCR. Overall, sex hormones E2 and P4 enhanced the infectivity of AH-1 and LE cells, while penicillin had the opposite effect. Penicillin-treated C. abortus cultures showed, for the first time in this species, characteristic features of persistent infection such as appearance of small inclusions containing enlarged aberrant reticular bodies, and a gene profile characterised by general up-regulation of genes related to stress response and a down-regulation of genes related to membrane protein synthesis and cell division, regardless of the cell line used. The genes omcA and omcB (membrane proteins), dnaK (stress response) and hctA (conversion of reticular bodies to elementary bodies) are proposed as markers of the penicillin-induced persistent state in vitro in Chlamydia abortus. In contrast, the supplementation with hormones produced different results depending on the cell line used, suggesting that the effects of hormones on the chlamydial developmental cycle are indirect, via host cells. In addition, Progesterone and, to a lesser degree, 17β-estradiol induced the morphology of aberrant bodies in LE cultures, although this fact did not associate with alterations in studied genes in Chlamydia abortus. Therefore, a common pattern of gene expression, valid for different systems of chlamydial persistence induction, cannot be established.
Primary author: Álvarez Sánchez, Daniel
Director: Salinas Lorente, Lázaro Jesús
Caro Vergara, María Rosa
Faculty / Departments / Services: Escuela Internacional de Doctorado
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/65142
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 149
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
Appears in Collections:Ciencias de la Salud

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