Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/65119

Title: Modo de acción molecular de CarH, el prototipo de una nueva familia de fotorreceptores dependientes de la vitamina B12 : plasticidad en su oligomerización, unión al DNA y diseño de su operador
Issue Date: 7-Dec-2018
Date of creation: 30-Nov-2018
Publisher: Universidad de Murcia
Related subjects: CDU::5 - Ciencias puras y naturales::57 - Biología::577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
Keywords: Ácidos nucléicos.
Genética molecular
Abstract: Para responder a la luz los organismos emplean proteínas fotorreceptoras. Se ha descubierto una familia de fotorreceptores bacterianos que utilizan como cromóforo un derivado de vitamina B12, la 5'-desoxiadenosilcobalamina (AdoCbl), un descubrimiento que reveló una nueva faceta biológica de esta vitamina como sensor de luz. El prototipo de dicha familia, CarH, es un represor transcripcional que generalmente regula la expresión fotoinducible de su propio gen, y de aquellos involucrados en la síntesis de carotenoides para mitigar el daño fotooxidativo. El mecanismo de acción más estudiado es el del homólogo de Thermus thermophilus, TtCarH. En oscuridad, ApoTtCarH es un monómero que, cuando se une a AdoCbl, forma un tetrámero capaz de unirse al DNA operador y reprimir la transcripción. La fotólisis de AdoCbl provoca el desensamblaje del tetrámero a monómeros incapaces de unirse al operador. Las estructuras del tetrámero de TtCarH, libre y unido al DNA, y del monómero expuesto a luz han proporcionado información a nivel atómico sobre su arquitectura y modo de acción, que ha sido corroborada por extensos análisis mutacionales e in vitro. Las proteínas CarH están formadas por un dominio autónomo N-terminal de unión a DNA (DBD) tipo hélice-“alada”, similar al de las proteínas MerR, conectado mediante un linker flexible a un dominio sensor de luz C-terminal también autónomo, de unión a cobalamina y responsable de la oligomerización que contiene dos subdominios: un haz de cuatro hélices α y un subdominio de plegamiento tipo Rossmann. Aunque el dominio sensor de luz de CarH es similar al módulo de unión a metilcobalamina de la sintetasa de metionina, CarH se une a AdoCbl, y esto depende de un motivo W-x(9)-EH que está conservado en los homólogos de CarH. En oscuridad, dos dominios C-terminal unidos a AdoCbl se agrupan con una disposición inusual cabeza-cola para formar un dímero, y dos dímeros se ensamblan como un tetrámero, posicionándose los cuatro DBDs en la superficie de la proteína. Esto resulta en un modo único de unión al DNA, donde el tetrámero de TtCarH utiliza tres de sus cuatro DBDs para unirse a tres repeticiones directas en tándem de 11 pares de bases (DRs) con una secuencia consenso 5’-nAnnTnnACAn-3’. La repetición central solapa con el elemento -35 del promotor reconocido por la RNA polimerasa asociada al factor A mayoritario. La pérdida del grupo 5'-desoxiadenosilo por la fotólisis de AdoCbl conlleva un desplazamiento del haz de hélices α respecto al plegamiento tipo Rossmann, lo que provoca la disociación del tetrámero y la pérdida de unión al DNA. En este trabajo también se describe un segundo homólogo de CarH, BmCarH, de la bacteria Gram-positiva Bacillus megaterium. ApoBmCarH es un glóbulo fundido que no es capaz de unirse al DNA. La unión de AdoCbl en la oscuridad, que depende del motivo conservado W-x(9)-EH, genera un tetrámero plegado correctamente que se une al DNA. En luz, el tetrámero se disocia a dímeros, y no a monómeros. El análisis de la unión al DNA de BmCarH-DNA reveló un diseño de operador similar al de TtCarH, que solapa con el elemento promotor -35 o -10, pero más grande por presentar una DR adicional. Curiosamente, BmCarH puede unirse al operador de TtCarH con tres repeticiones y TtCarH a tres DRs contiguas de un operador de BmCarH con cuatro repeticiones. La flexibilidad de unión al DNA exhibida por BmCarH puede estar relacionada con su linker más largo. En conjunto, los resultados revelan una plasticidad insospechada en el modo de oligomerización, arquitectura del operador y unión al DNA en los fotorreceptores de la familia CarH que tiene relevancia tanto en su función biológica como en su uso como herramienta en optogenética.
Living organisms employ photoreceptor proteins to respond to light. A recently discovered family of bacterial photoreceptors sense light using as chromophore the vitamin B12 form known as 5′- deoxyadenosylcobalamin (AdoCbl), a finding that unveiled a novel biological facet of this vitamin, that as a light-sensor. The prototype of this family, CarH, is a transcriptional repressor that usually regulates light-dependent expression of its own gene, and of those involved in the synthesis of carotenoids that help mitigate photooxidative damage. The molecular mechanism of action is best understood for the Thermus thermophilus homolog, TtCarH. ApoTtCarH is a monomer that, in the dark, binds to AdoCbl to form a tetramer, which binds to operator DNA and represses transcription. Light disrupts AdoCbl and thereby the tetramer to monomers unable to bind operator DNA. Structures of the TtCarH tetramer, free and bound to DNA, and of the light-exposed monomer provided atomic level insights into its architecture and mode of action. This was corroborated by extensive mutational and in vitro analysis. TtCarH is composed of an autonomous N-terminal winged-helix DNA binding domain (DBD) similar to those in MerR proteins. It is connected by a flexible linker to an autonomous AdoCbl-binding, light-sensing, oligomerization domain comprising two subdomains: a four-helix bundle and a Rossmann-fold. Although very similar in structure to the methionine synthetase methylcobalamin-binding module, the CarH AdoCbl-binding domain binds to the larger AdoCbl, and this depends crucially on a W-x(9)-EH motif that is highly conserved among CarH homologs. Two AdoCbl-bound C-terminal domains pack as head-to-tail dimers, and two such dimers assemble as tetramer in the dark in which the four DBDs are splayed around the surface. This results in a unique mode of DNA binding in which the TtCarH tetramer uses three of its four DBDs to contact three contiguous 11 base-pair direct repeats (DRs) with a consensus 5'-nAnnTnnACAn-3' sequence. The operator overlaps with the -35 element of a promoter recognized by RNA polymerase holoenzyme containing the major A factor. Photolysis of TtCarH-bound AdoCbl releases the 5´-deoxyadenosyl group and produces a large shift in the four-helix bundle relative to the Rossmann fold to provoke tetramer disassembly and loss of DNA binding. Work in this thesis also describes a second homolog, BmCarH, from the Gram-positive bacterium Bacillus megaterium. ApoBmCarH is an oligomeric molten globule that does not bind DNA. However, AdoCbl binding in the dark results in a BmCarH tetramer with the proper fold for DNA-binding, and the conserved W-x(9)-EH motif is crucial for this. The tetramer is again disrupted by light but to dimers and not monomers. Analysis of BmCarH-DNA binding revealed an operator design similar to that for TtCarH, which overlaps with the -35 or the -10 promoter element and is larger by an additional 11 base pair DR. Interestingly, BmCarH could bind to the three-repeat TtCarH operator, and TtCarH to three contiguous DRs of the four-repeat CarH operator. This DNA binding adaptability of BmCarH may stem from its longer linker between the DNA and AdoCbl-binding domains. Altogether, there is a remarkable plasticity in the oligomerization, operator architecture and DNA binding among CarH photoreceptors within an overall conserved mode of action, which is relevant for its biological function and use as an optogenetics tool.
Primary author: Fernández Zapata, Jesús
Director: Elías Arnanz, Montserral
Padmanabhan Iyer, Subramanian
Faculty / Departments / Services: Escuela Internacional de Doctorado
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/65119
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 223
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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