Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/64859

Title: El complejo Card-Carg y su implicación en una nuevo mecanismo de regulación de la expresión de un sistema CRISPR-Cas
Issue Date: 29-Nov-2018
Date of creation: 27-Nov-2018
Publisher: Universidad de Murcia
Related subjects: CDU::5 - Ciencias puras y naturales::57 - Biología::579 - Microbiología
Keywords: Microbiología
Abstract: La bacteria Myxococcus xanthus presenta un complejo regulador de acción global constituido por las proteínas CarD y CarG que participa en la respuesta a la luz y en el desarrollo multicelular. CarD presenta un dominio C-terminal de unión al DNA similar al observado en los factores arquitectónicos eucarióticos HMGA, y un dominio N-terminal (CarDNt), que define a la familia de proteínas PF02559, que interacciona con CarG y con la polimerasa de RNA (RNAP). La proteína CarG, por otro lado, regula la expresión génica interaccionando con CarD, sin unirse directamente al DNA. Ambas podrían funcionar a modo de un “enhanceosoma” bacteriano. Este complejo es esencial para la acción de varios factores σ de tipo ECF (ExtraCytoplasmic Function) que responden a señales del medio para dar una respuesta fisiológica adecuada. En este trabajo se ha demostrado que CarDNt es esencial para la función de CarD y se ha determinado la estructura del subdominio de interacción con la RNAP (CarD1-72), que adopta una estructura tipo Tudor similar a la observada en CdnL, otro regulador global de M. xanthus que forma parte de la misma familia que CarD. El análisis mutacional de este subdominio ha permitido observar que, pese a que la superficie de interacción con la RNAP está conservada en CarD y en CdnL, dichas mutaciones no eliminan la actividad de CarD, a diferencia de lo observado en CdnL. Por otro lado, mediante la mutagénesis de varios aminoácidos no polares y básicos del subdominio C-terminal de CarDNt, se ha visto que estos cumplen un papel importante en la función de CarD, no relacionado con la interacción con CarG. Además, se ha profundizado en el estudio de las parejas σ-ECF/anti-σ: CarQ/CarR, que participa en la respuesta carotenogénica, y DdvS/DdvA, que está implicada en la regulación de un sistema CRISPR-Cas. Se ha identificado la topología en la membrana de sus factores anti-σ, CarR y DdvA, así como el dominio de interacción con sus respectivos factores σ-ECF. De la misma manera, se han analizado otras posibles parejas σ-ECF/anti-σ, cuyo factor anti-σ presenta un dominio NZAS asociado a un dominio eSTK. Para comprender el modo de acción del complejo CarD-CarG en la regulación de los factores σ-ECF, se ha demostrado que CarD y CarG colocalizan in vivo, lo que refuerza la idea de que ambas proteínas funcionan siempre juntas y de que CarG se localiza en el DNA a través de su interacción con CarD. Además, se ha demostrado que la unión de CarD a las regiones promotoras de carQ o ddvS requiere la activación de dicho promotor y la presencia de CarG. En relación a su acción reguladora sobre la pareja DdvS/DdvA, este trabajo ha demostrado que el complejo CarD-CarG modula junto a DdvS/DdvA la expresión de un sistema CRISPR-Cas de tipo III-B, en el que se han identificado cuatro promotores activados por DdvS y dependientes de CarD-CarG, que incluye a un promotor localizado aguas arriba del operón cas. Consistente con una acción directa, DdvS y CarD-CarG se localizan en estos promotores in vivo. La expresión de este sistema CRISPR-Cas genera un largo transcrito que incluye a los genes cas, la región CRISPR y su segmento líder, donde se ha observado un posible promotor dependiente de σA que no presenta una actividad significativa in vivo. Por tanto, la expresión de este sistema CRISPR-Cas, así como la producción de CRISPR-RNA maduros (crRNA) depende de DdvS y CarD-CarG.   The bacterium Myxococcus xanthus has a global regulatory protein complex formed by CarD and CarG, which participates in the response to light and starvation-induced multicellular development. CarD contains a C-terminal DNA binding domain similar to that observed in the eukaryotic architectural factors HMGA, and a N-terminal domain (CarDNt), defining the protein family PF02559, which interacts with CarG and with the RNA polymerase (RNAP). CarG does not bind to DNA directly, but can regulate gene expression via its interaction with CarD. Both proteins could act together as a type of bacterial enhanceosome. The CarD-CarG complex is necessary for the action of several ECF-type (ExtraCytoplasmic Function) σ factors that respond to extracellular signals to provide an appropriate physiological response. In this work, it has been shown that CarDNt is essential for CarD function, and the structure of the RNAP interacting segment (CarD1-72) has been determined. CarD1-72 adopts a Tudor-like structure similar to that described for CdnL, another global regulator of M. xanthus belonging to the same family as CarD. Mutational analysis has proved that, although the RNAP interaction surface is conserved in CarD and CdnL, mutations within CarD1-72 do not abolish CarD activity, in contrast to what is observed in CdnL. In addition, it has been shown that mutations in several non-polar and basic amino acids within the C-terminal CarDNt segment disrupt CarD function, whereas its interaction with CarG remains unaffected. Also, two pairs of ECF-σ/anti-σ factors: CarQ/CarR, which controls the carotenogenic response, and DdvS/DdvA, which drives the expression of a CRISPR-Cas system, have been further analyzed. The topology inside the membrane of the anti-σ factors CarR and DdvA has been established, as well as the interacting domain with their respective ECF-σ factors. Similarly, other possible ECF-σ/anti-σ pairs, in which the anti-σ factor contains a NZAS domain associated to a eSTK domain, have been studied. In order to understand the mechanism by which the CarD-CarG complex regulates ECF-σ factors, CarD and CarG colocalization experiments have been carried out, proving that CarD and CarG colocalize in vivo, which supports the notion that both proteins always act together as a complex and that CarG is recruited to DNA through its interaction with CarD. Moreover, it has been demonstrated that the binding of CarD to the carQ or ddvS promoter regions requires both an active state of the promoter and the presence of CarG. Regarding their action on DdvS/DdvA, this work has revealed that the CarD-CarG complex, together with DdvS/DdvA, regulate the expression of a type III-B CRISPR-Cas system, in which four DdvS-activated CarD-CarG-dependent promoters have been identified, with one of them lying upstream of the cas operon. Consistent with their direct action, DdvS and CarD-CarG localize at these promoters in vivo. The expression of this CRISPR-Cas system generates a long transcript that comprises the cas genes, the CRISPR locus and the leader segment, which has a possible σA-dependent promoter but with no significant activitity in vivo. It can therefore be concluded that expression of the CRISPR-Cas system, as well as mature CRISPR-RNA (crRNA) production, depend on the ECF-σ factor DdvS and the CarD-CarG complex.
Primary author: Bernal Bernal, Diego
Director: Elías Arnanz, Montserrat
Padmanabhan Iyer, Subramanian
Faculty / Departments / Services: Escuela Internacional de Doctorado
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/64859
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 202
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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