Efectos moleculares de nuevos agentes promotores de la migración celular y la reepitelización de heridas : membrana amniótica y ácido oleanólico

Abstract

La cicatrización de heridas es un proceso complejo que implica diferentes etapas que tienen como objetivo restaurar la integridad del tejido lesionado. Si se interrumpe el proceso normal de curación, se puede llegar a desarrollar lesiones no cicatrizantes conocidas como heridas crónicas. Éstas, por definición, son heridas que no son capaces de epitelizar de forma correcta y por tanto, incapaces de progresar a través de las etapas normales de la curación. La evidencia acumulada muestra como algunos agentes parecen ser capaces de revertir esta situación y facilitar la epitelización de estas heridas. Entre ellos parece destacar las habilidades de un tejido perinatal, la membrana amniótica (MA), y las de un extracto vegetal, el ácido oleanólico (AO). El objetivo principal de esta investigación es el de profundizar en el conocimiento de aquellos mecanismos moleculares por los cuales la MA y el AO pueden contribuir a la reepitelización de lesiones cutáneas. Para ello se han desarrollado numerosos experimentos orientados a evaluar los efectos de estos agentes sobre la migración y la proliferación, así como su efecto sobre el comportamiento de rutas moleculares cruciales para estos procesos. En la ejecución de esta estrategia se han empleado diferentes modelos de células epiteliales, como son las células de epitelio pulmonar de armiño (Mv1Lu), las células epiteliales de mama humana (MDA-MB-231) o los queratinocitos espontáneamente inmortalizados humanos (HaCaT). Para ponderar el efecto de la aplicación de MA y el AO sobre la migración celular, se han realizado estudios de cierre de heridas in vitro en presencia de MA o AO junto con inhibidores de rutas específicas. Esta aportación ha permitido comprender como la MA y el AO promueven la migración celular mediante la activación de la vía de las MAPK, incluyendo ERK y JNK, a parte de otras rutas aguas arriba de estas. Así se ha comprobado que la migración promovida por la MA se ve afectada por el inhibidor de la ruta de TGF-β, mientras que la migración fomentada por el AO se afecta por la inhibición del receptor de EGF. En cuanto a los efectos sobre la proliferación, en el caso de MA se había indicado por otros autores que es un agente pro-proliferativo que promueve la división celular, observación que quedó confirmada en nuestros ensayos. El AO, en cambio, parece ejercer cierta influencia negativa sobre la proliferación a corto plazo sin afectar al ciclo celular. Junto con los estudios indicados se realizaron otros de expresión génica, perfilados para concretar el efecto de MA y AO sobre genes involucrados en proliferación y migración celular. Los resultados mostraron como tanto el AO como la MA son capaces de alterar el perfil de expresión de genes relevantes implicados en la migración celular, como son el SNAI2, c-JUN y PAI-1, así como genes involucrados en la regulación del ciclo celular, como CDKN1A. Por último, para obtener una visión de conjunto, se realizó la observación microscópica mediante técnicas de inmunofluorescencia, que permiten caracterizar el efecto que la exposición a MA o AO, como agentes promotores del cierre de heridas, tiene sobre la arquitectura celular en relación con la migración celular. Así en experimentos de cierre de heridas se puede observar en el borde de la herida como la MA efectivamente atenúa la señalización nuclear de las Smad. Además, se observó como el tratamiento con MA es capaz de promover el remodelado de los focos de adhesión de células Mv1Lu y HaCaT, induciendo la expresión de Paxilina y aumentando el dinamismo de los complejos focales en las células migratorias. Además, este dinamismo se correlacionó con el aumento de la activación de la Kinasa de Adhesión Focal (FAK) en el borde de migración de células HaCaT. Con el tratamiento de AO se observó su habilidad para promover la internalización de los receptores de EGF, al igual que ocurre con el tratamiento con el ligando nativo. Todos estos datos nos llevan a proponer el concurso de diversas rutas moleculares en la migración promovida tanto por MA como por AO. Así, la estimulación de la migración celular provocada por MA estaría contribuida por un efecto atenuador de este agente sobre la señalización dependiente de TGF-β por la ruta de las Smad, un efecto observado tanto en células Mv1Lu y como en células HaCaT. Además, la MA desencadena el reclutamiento de la ruta de las MAP Kinasas involucrando al receptor de EGF, promoviendo la activación de MEK1 y la fosforilación de c-Jun en el borde migratorio, fenómeno que es crucial para el correcto cierre de la herida. Con respecto al AO, los efectos de este agente parecen implicar también la activación del receptor de EGF, abarcando esto la activación de las rutas de las MAP kinasas, y en concreto de JNK y de MEK. Todo ello conduce al desarrollo de un perfil de expresión génica coherente con la adquisición de habilidades de remodelación tisular similares a un estatus de Transición Epitelio-Mesénquima (EMT), que queda evidenciado por cambios en la cito- arquitectura y el aumento de la migración. El conocimiento de la forma de actuar de estos agentes puede abrir oportunidades para futuras innovaciones en el desarrollo para el manejo y la regeneración de heridas crónicas. The cicatrisation of wounds is a complex process which implies different stages whose objective is to restore the integrity of the damaged tissue. If the normal process of healing is impaired, non-healing wounds can develop. Better described as chronic wounds, these are lesions that are unable to progress through the normal healing stages and thus they cannot to epithelize. The accumulated evidence shows the ability of some agents to promote the reversion of this situation and facilitate the epithelialization of these wounds. Amongst them it seems to stand out the abilities of a perinatal tissue, the amniotic membrane (AM), and the ones of a plant extract, the oleanolic acid (OA). The main objective of this research is to contribute to the knowledge of those molecular mechanisms through which the AM and the OA can promote the reepithelialization of skin wounds. For that purpose, several experiments have been directed to evaluate the effects of these agents on the functional properties of epithelial cells, migration and proliferation, as well as its effects on crucial molecular routes for these processes. In the execution of this strategy different types of epithelial cells have been employed, including mink lung epithelial cells (Mv1Lu), human breast epithelial cells MDA-MB-231 and the spontaneously immortalised human keratinocytes HaCaT cell line. To consider the effect of AM and OA on cell migration, artificial wound closure studies were executed in vitro in the presence of AM or OA, along with inhibitors of specific routes. This has allowed to understand how both AM and OA stimulate cell migration through the activation of the MAP Kinase pathway, including ERK and JNK. Also, it was proved that the migration promoted by the AM was affected by inhibiting TGF-ß signalling, whereas the migration promoted by the OA was affected by the inhibition of EGF receptor. Regarding the effects on proliferation, in the case of AM, as proposed by other authors, we confirmed that it promotes cell division and proliferation. In the case of OA, on the other hand, it seems to exert certain negative influence on the proliferation in the short term without affecting the cell cycle. Together with the indicated research, genetic expression studies were performed as well, aiming to define the transcriptomic effects of AM and OA on genes involved in cell proliferation and migration. The obtained results showed that both OA and AM are capable of altering the expression profile of relevant genes involved in cell migration, such as SNAI2, c-JUN and PAI-1, as well as genes involved in the regulation of the cell cycle, like CDKNIA. Furthermore, in order to obtain a complete vision, microscopy studies were carried out through inmunofluorescense techniques, allowing to precisely characterise the effects that the exposure to AM or OA has on the cell architecture and in relation to cell migration. At the migrating edge of artificial wound closure experiments, it was observed how the AM absolutely abates the nuclear signature of the SMADs. Moreover, it was proved how the treatment with AM was capable of promoting the remodelling of the focal adhesions of MV1LU and HaCaT cells, inducing the expression of paxillin, while also increasing the dynamism of the focal complexes in the migrating cells. This dynamism was related to an increase of the activation state of the focal adhesion kinase (FAK) on the migrating edge of HaCaT cells. Regarding the treatment with OA, its ability to promote the internalization of the EGF receptors was proved, the same as it occurs with the exposure the native ligand. These data make us propose the concurrence of diverse molecular routes in the migration promoted either by AM or OA. So, the stimulation of the cell migration caused by AM would be contributed by a mitigating effect on the signalling dependent on TGF-ß through the route of the SMADs, an effect observed both in Mv1Lu cells and as in HaCaT cells. Moreover, the AM triggers the recruitment of the MAP kinase pathway, involving the EGF receptor and promoting the activation of MEK1 jointly with the phosphorylation of c-Jun, a phenomenon that is crucial for cell migration at the edge and a correct wound closure. Regarding the OA, the effects of this agent also seem to involve the activation of the EGF receptor, also implying the activation of the MPA kinase pathway and specially JNK. This is coherent with the development of an expression profile indicative for the acquisition of tissue remodelling abilities, similar to a status of epithelial-mesenchymal transition, which is proved by changes in the cyto-architecture and the increase of migration. This specific knowledge disclosing the way of acting of these agents may open opportunities for future innovations in the management of chronic wounds.