Caracterización de Caiap y Wdr90 como nuevos componentes del inflamasoma implicados en la resistencia a Salmoella enterica serovar Typhimurium

Abstract

Los inflamasomas son plataformas moleculares citosólicas que alertan al Sistema inmunitario de la presencia de infecciones. Como complejos multiproteicos, están constituidos por NLRs (Receptores tipo NOD), proteínas adaptadoras (ASC) y caspase-1. El ensamblaje de los complejos requiere una señal activadora y depende de interacciones homotípicas. Nuestro laboratorio ha encontrado que la proteína 4 que une a guanilato (Gbp4), una GTPasa inducible por IFNγ con un dominio CARD C-terminal, se necesita para la eliminación de Salmonella Typhimurium (ST) dependiente de inflamasoma realizada por los neutrófilos in vivo. Aunque muchos de los componentes clave del inflamasoma ya han sido caracterizados, aun se conoce muy poco acerca de otros componentes potenciales. En esta Tesis Doctoral se describen dos nuevos componentes del inflamasoma y se han desarrollado además anticuerpos en alpacas contra componentes del inflamasoma como una herramienta para clarificar el ensamblaje del inflamasoma y su función. Por un lado, describimos la identificación de una proteína evolutivamente conservada, a la que nombramos como Caiap (proteína adaptadora del inflamasoma con dominio CARD y ANK), que presenta un dominio CARD N-terminal, 16 dominios ANK C-terminales y que se necesita para la resistencia a ST dependiente de inflamasoma en pez cebra. Enigmáticamente, Caiap está muy conservada desde peces cartilaginosos hasta marsupiales, pero se encuentra ausente en mamíferos placentarios. El mecanismo de actuación de Caiap ocurre aguas debajo de flagelina e interacciona con Caspa catalíticamente activa, el homologo funcional de caspasa-1 humana, a través de sus dominios ANK, mientras que los dominios CARD promueven su oligomerización. Nuestros resultados apuntan por tanto a que proteínas con dominios ANK son adaptadores clave necesarios para la estabilización funcional de caspasa-1 en complejos de alto peso molecular. Por otro lado, se describe cómo wdr90 en pez cebra se induce por Gbp4 de manera independiente de la activación del inflamasoma. Este gen codifica para una proteína de alto peso molecular con numerosos dominios WD40, que están involucrados en coordinar el ensamblaje de complejos multiproteícos, cuya función era desconocida hasta la fecha. Se ha visto como su sobreexpresión aumenta los niveles de actividad caspasa-1 y la resistencia a ST en larvas infectadas de pez cebra, actuando aguas arriba de Caspa y Asc. Además, se muestra como su expresión en HEK293T es capaz de alterar la distribución de NLRC4, pero no de NLRP3 y AIM2. Por último, hemos generado un knockout de WDR90 en líneas inmortalizadas de macrófagos de ratón y herramientas CRISPR para generar un knockin con el fin de marcar el WDR90 con un epítopo FLAG para facilitar su detección. Asimismo, se han producido anticuerpos en alpaca contra Asc de pez cebra y WDR90 humano, lo que facilitará en un futuro a comprender en mayor detalle el ensamblaje, activación y la función biológica del inflamasoma. Inflammasomes are cytosolic molecular platforms that alert the immune system about the presence of the infection. As multiprotein complexes, they consist of NLRs (NOD-like receptors), adaptor proteins ASC and caspase-1. The assembly of the complexes requires the activation signal and depends on the homotypic interactions. Our laboratory has found that zebrafish guanylate-binding protein 4 (Gbp4), an IFNγ-inducible GTPase harbouring a C-terminal CARD domain, is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium (ST) by neutrophils in vivo. Although several key components of the inflammasome have already been characterized, little is known about other potential components. In this Thesis we describe two new inflammasome components and we developed antibodies against inflammasome components in Alpacas as tools to shed light in to inflammasome assembly and function. On one hand, we report the identification of an evolutionarily conserved protein, that we term Caiap (from CARD- and ANK-containing Inflammasome Adaptor Protein), which has an N-terminal CARD domain and 16 C-terminal ANK domains, and is required for the inflammasome-dependent resistance to Salmonella Typhimurium in zebrafish. Intriguingly, Caiap is highly conserved from cartilaginous fish to marsupials but is absent in placental mammals. Mechanistically, Caiap acts downstream flagellin and interacts with catalytic active Caspa, the functional homolog of mammalian caspase-1, through its ANK domain, while its CARD domain promotes its self-oligomerization. Our results therefore point to ANK domain-containing proteins as key inflammasome adaptors required for the stabilization of active caspase-1 in functionally stable, high molecular weight complexes. On the other hand, we found that zebrafish wdr90 is highly induced by Gbp4 independently of inflammasome activation. This gene encodes a large protein of unknown functions until date that contains several WD40 domains, which are involved in coordinating multi-protein complex assembly. Its overexpression increased caspase-1 activity and the resistance of the larvae to ST infection, acting upstream of Caspa and Asc. In addition, it was able to alter the distribution of NLRC4, but not of NLRP3 or AIM2, when expressed in HEK293T cells. Finally, we have generated WDR90 knockout immortalized bone marrow-derived macrophages and the CRISPR tools to generate KI cell lines to tag endogenous WDR90 with the FLAG epitope to facilitate its detection. In addition, we have produced alpacas antibodies against zebrafish Asc and human WDR90, which will help to shed light into inflammasome assembly, activation and biological functions