Proteómica del plasma seminal y de los espermatozoides de porcino

Abstract

Conscientes de la importancia de las proteínas para la funcionalidad espermática, el objetivo de la Tesis Doctoral fue identificar proteínas espermáticas y del plasma seminal (PS) de porcino asociadas con la funcionalidad espermática, específicamente con la fertilidad y la congelabilidad, todo ello a partir de una detallada descripción y actualización de los proteomas del plasma seminal (PS) y de los espermatozoides de porcino. Se desarrollaron 5 experimentos, 3 basados en el proteoma del PS (estudios 1, 2 y 3) y otros 2 en el proteoma de los espermatozoides (estudios 4 y 5). Para dichos experimentos, se utilizaron muestras de PS y/o espermatozoides de 313 eyaculados, recogidos de manera fraccionada (10 primeros mL de la fracción rica [FR], resto de la FR y la fracción post-FR) o como eyaculado completo, procedentes de 89 verracos utilizados en programas de inseminación artificial. También se utilizaron muestras de espermatozoides procedentes de la cola del epidídimo (estudio 4) y de espermatozoides criopreservados mediante un procedimiento estándar para pajuelas de 0,5 mL (estudio 5). Para el análisis proteómico, las proteínas de PS y de los espermatozoides fueron digeridas con tripsina y los péptidos resultantes fueron sometidos a diferentes sistemas de fraccionamiento antes de ser analizados mediante espectrometría de masas (MS). El proteoma se analizó por cromatografía líquida acoplada a MS en tándem y las proteínas resultantes fueron cuantificadas mediante SWATH (Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra; estudios 1, 2, 3 y 5) o iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation; estudio 4). La fertilidad de los verracos (estudio 3), se valoró, tras inseminar 25.069 cerdas, en términos de tasa de parto (porcentaje de cerdas que paren con respecto al número de cerdas inseminadas) y tamaño de la camada (número de lechones nacidos por parto). La calidad y funcionalidad espermática (estudio 5) se evaluó como motilidad objetiva (total y progresiva), viabilidad, fragmentación del ADN nuclear, peroxidación lipídica y apoptosis celular temprana. Se identificaron un total de 872 y 1.723 proteínas en el PS (estudios 1 y 2) y en los espermatozoides (estudio 4), respectivamente, siendo 679 y 1.602 de ellas cuantificadas. Se identificaron, tanto en el proteoma del PS (estudio 1) como en el de los espermatozoides (estudio 4), proteínas que estaban cuantitativamente diferentemente expresadas entre las fracciones del eyaculado, siendo muchas de ellas relevantes para la funcionalidad espermática. Algunas de las proteínas diferencialmente expresadas eran comunes para el PS y los espermatozoides, evidenciando que el proteoma de los espermatozoides de porcino se remodela durante la eyaculación debido a su interacción con el PS. En el estudio 3, se identificaron un total de 11 y 4 proteínas del PS diferencialmente expresadas entre verracos con diferencias en tasa de parto y tamaño de camada, respectivamente, proteínas con potencial para ser utilizadas como biomarcadores de fertilidad. Finalmente, en el estudio 5, se identificaron 26 proteínas en el proteoma de los espermatozoides criopreservados que diferían cuantitativamente entre muestras espermáticas con claras diferencias en la congelabilidad. En conclusión, la presente Tesis Doctoral aporta la descripción más extensa y actualizada de los proteomas del PS y de los espermatozoides de porcino, demostrando que el proteoma de los espermatozoides se remodela durante la eyaculación e identificando proteínas en el proteoma de los espermatozoides y del PS que estarían directamente implicadas en la congelabilidad espermática y en la fertilidad, respectivamente.Proteins are essential for sperm function, including their fertilizing capacity. Consequently, the aim of the PhD Thesis was to describe and update the proteomes of porcine seminal plasma (SP) and spermatozoa, respectively; identifying proteins related to sperm freezability and fertility after artificial insemination (AI). Five experimental studies were performed, three focused on the SP proteome (studies 1, 2 and 3) and the other two on the sperm proteome (studies 4 and 5). Sperm and SP samples were derived from 313 ejaculates (89 boars), collected either in fractions (the 10 first mL of the sperm rich fraction [SRF], the remainder of the SRF and the post-SRF) or as an entire ejaculate. In addition, epididymal (study 4) and cryopreserved spermatozoa (study 5) were also used. For proteomic analysis, the SP and sperm proteins were digested by trypsin, the resulting peptide mixtures subjected to different fractionation approaches before mass spectrometry (MS) analysis. Liquid chromatography-tandem MS was used for proteome analysis. Quantitative differences in protein composition were analyzed either by SWATH (Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra; studies 1, 2, 3 and 5) or by iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantitation, study 4). The fertility of the boars (study 3), as farrowing rates (FR, number of farrowing sows respect to the number of inseminated sows) and litter size (LS, total number of piglets born per litter) was recorded from 25,069 sows after AI. Sperm function (study 5) was assessed in terms of total and progressive motility, viability, nuclear DNA fragmentation, membrane lipid peroxidation and early signs of apoptosis. A total of 872 proteins in SP (studies 1 and 2) and of 1,723 in spermatozoa (study 4) were identified; of which 679 respectively 1,602 were quantified. Several proteins, many of them relevant for sperm function, were identified as quantitatively differently expressed among ejaculate fractions in both SP (study 1) and sperm (study 4) proteomes. Some of these were common for SP and spermatozoa, revealing that the proteome of pig spermatozoa is remodeled during ejaculation through interaction with the surrounding SP. In study 3, a total of 11 and 4 differentially expressed proteins were identified in SP from boars with differences in farrowing rate and litter size, respectively. These proteins are revealed as potential fertility biomarkers of boar used in AI programs. Finally, study 5 identified 26 sperm proteins differentially expressed between samples showing differences in freezability. This PhD Thesis provides the most extensive and updated description of SP and pig sperm proteomes. It also evidences that the pig sperm proteome is remodeled during ejaculation and identifies proteins directly involved in sperm freezability and boar fertility in the proteome of spermatozoa and SP, respectively.