Por favor, use este identificador para citar o enlazar este ítem: http://hdl.handle.net/10201/62619

Título: Caracterización de la microbiota intestinal mediante next generation sequencing (NGS) en precursores neoplásicos del colon
Fecha de publicación: 26-oct-2018
Fecha de defensa / creación: 19-oct-2018
Editorial: Universidad de Murcia
Materias relacionadas: CDU::6 - Ciencias aplicadas::61 - Medicina::616 - Patología. Medicina clínica. Oncología::616.3 - Patología del aparato digestivo. Odontología
Palabras clave: Colon-Cáncer
Resumen: Objetivos:Nuestro objetivo consistió en la caracterización mediante técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) de la microbiota intestinal en muestras de pólipos de colon así como en muestras de mucosa sana colónica .Se analizaron las diferencias encontradas en la composición bacteriana de los pólipos según los distintos tipos histológicos, distintas localizaciones anatómicas y la presencia o no de displasia alto grado con el fin de sugerir qué poblaciones bacterianas pudieran asociarse al inicio y desarrollo del cáncer colorrectal (CCR). Material y método: Se analizaron mediante NGS 53 muestras de tejido colónico donde 24 pertenecían a pólipos colónicos y 29 a mucosa sana. Los géneros/especies que mostraron diferencias significativas o resultaron de interés fueron cuantificados y validados por qPCR. Los pólipos colónicos se clasificaron según su histología en adenomas convencionales, pólipos serrados y pólipos mixtos, según su localización en el colon proximal o distal y según la presencia o no de displasia de alto grado/carcinoma in situ. Tras la extracción del DNA, para el análisis NGS, la amplificación de PCR se llevo a cabo empleando cebadores adaptados a ILLUMINA (“16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Protocol”).El estudio bioinformático para la limpieza de secuencias con obtención de secuencia solapante , procesamiento por calidad con eliminación de cebadores, eliminación de secuencias quimera y clasificación taxonómica se realizó mediante los programas “PEAR V.0.9.1” , “CUTADAPT versión 1.4.1.” ,“UCHIME” y “BLAST” respectivamente. El estudio de validación mediante qPCR se realizó con el uso de cebadores genéricos y específicos de género y especie del gen 16S RNA con la sonda inespecífica SybrGreen PCR Master Mix (QuantiTec-QUIAGEN).El análisis estadístico de los datos derivado de NGS se realizó mediante test de Wilcoxon (R-Studio) y los datos de qPCR mediante test U de Mann Withney (SPSS versión 21.0) . Resultados: Los pólipos colorrectales presentaron una mayor abundancia significativa de los géneros Escherichia (P=0.020), Bacteroides (P=0.002) y Flavonifractor (P=0.039) con respecto a las muestras de mucosa sana. En la mucosa sana el único género con mayor presencia significativa (P=0.05) fue Intestinibacter. En los adenomas convencionales se asociaron significativamente los géneros Roseburia, Eubacterium , Coprococcus , Streptococcus, Haemophilus, ,Fusicatenibacter y Erysipelatoclostridium respecto a pólipos serrados. La especie Escherichia coli fue más abundante (P<0.05) en pólipos mixtos respecto a pólipos serrados por qPCR . No se encontraron poblaciones bacterianas diferentes significativamente al comparar pólipos serrados con pólipos mixtos . Los pólipos localizados en colon distal presentaron una mayor presencia significativa del género Bacteroides (P=0.033) . La especie Escherichia coli fue más abundantes en colon proximal (P  0.05) respecto a colon distal. La especie Escherichia coli predominó de forma significativa en pólipos con displasia alto grado/carcinoma in situ respecto a pólipos sin displasia. Los pólipos sin presencia de displasia mostraron una mayor presencia del género Eubacterium de forma significativa (P=0.05) respecto a los pólipos con presencia de displasia alto grado/carcinoma in situ mediante NGS. La especie Escherichia coli fue mas abundante (<0.05) en pólipos con displasia de alto grado. Conclusiones:Los géneros prooncogénicos , Bacteroides y Escherichia, se asociaron de forma significativa a pólipos de colon respecto a mucosa sana colónica. El género Intestinibacter con un potencial papel probiótico está asociado de forma significativa a mucosa sana del colon. Los adenomas convencionales mostraron una composición bacteriana diferente respecto a pólipos serrados con mayor presencia de géneros con actividad antiinflamatoria como Roseburia, Coprococcus, Eubacterium y Fusicatenibacter pudiendo contribuir a ralentizar la evolución menos agresiva del CCR convencional comparado con el CCR serrado. Hemos encontrado un perfil bacteriano diferente según la localización anatómica de los pólipos colónicos mostrando el género Bacteroides una asociación significativa en lesiones situadas en colon distal respecto a las de colon proximal y la especie Escherichia coli asociada significativamente a lesiones de colon proximal. La especie proinflamatoria Escherichia coli se asoció a pólipos avanzados con displasia mientras que el género Eubacterium con propiedades antitumorales se asoció a pólipos sin displasia. Las diferencias observadas en las poblaciones bacterianas entre los grupos del estudio aportan nuevas evidencias que podrían contribuir a la compresión del papel de la microbiota en la carcinogénesis colorrectal . Objectives: The aim of this study was to characterize, through next-generation sequencing (NGS) the colonic microbiota in samples from colonic polyps and normal mucosa. We also studied the bacterial communities associated to specific colorectal polyp types, advanced polyps and anatomical location to determine a bacterial profile associated with the early stage of colorectal carcinogenesis Materials and Methods: 53 tissue samples from colonic polys (24) and normal colonic mucosa (29) were analysed throug NGS. Genus and species wich were significantly different were validated by quantitative PCR (qPCR) . Colonic polys were classificated according to the histological type (adenomatous, serrated and mixed polyp) , according to different anatomic locations (proximal and distal colon) and according to high-grade dysplasia (HGD) / early-stage carcinoma or not. After DNA extraction, PCR amplification was performed using adapted primers as recommended by Illumina (“16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Protocol”).NGS analysis of microbial community structure in each simple was performed with Miseq (Illumina) .The bioinformatics analysis for quality analysis, filtering secuences, chimeras withdrawal and taxonomic classification was performed using “PEAR V.0.9.1” , “CUTADAPT versión 1.4.1.” ,“UCHIME” and “BLAST” programs respectively. The validarion by qPCR was performed using 16S RNA gen specific primers for species or genus and the SybrGreen probe chemistry (QuantiTec-QUIAGEN). The statistical analysis of NGS and qPCR results was carried out by applying the T-Student , Wilcoxon test (R-Studio) and Mann-Withney test (SPSS versión 21.0) . Results:Genera Escherichia (P=0.020), Bacteroides (P=0.002) and Flavonifractor (P=0.039) were significantly more abundant in polyp group than in normal mucosa group. Intestinibacter (P=0.05) was the only genus we found significantly more abundant in normal mucosa group . Regarding the histological type of polyp we observed a significantly predominance of Roseburia, Eubacterium , Coprococcus , Streptococcus, Haemophilus, ,Fusicatenibacter y Erysipelatoclostridium (P0.05) in conventional adenoma group than serrated polyp group. Escherichia coli was more abundant (P<0.05) by qPCR in mixed polyp group than in serrated polyp group. No differences was observed between mixed group and conventional adenoma group. Genera Bacteroides (P=0.033) was significantly associated with de distal colon polyps group .Escherichia coli (P<0.05) was significantly more common in proximal colon polyps group by qPCR. Genus Eubacterium (P=0.05) was significantly associated with no dysplasia polyp group than high-dysplasia group. The proportions of Escherichia coli were significantly higher in high-dysplasia group (P<0.05) by qPCR . Conclusions:The proinflammatory genera, Bacteroides and Escherichia, were significantly associated with colon polyps. Intestinibacter, with probiotic activity , was significantly associated with normal colonic mucosa. Conventional adenomas showed differences in community composition with a microbial profile characterized by antiinflammatory genera such as Roseburia, Coprococcus, Eubacterium and Fusicatenibacter and it may contribute to a less aggressive evolution of conventional CRC compared with serrated CRC. We observed different bacterial profile according to the anatomic location of the colonic polyps, showing the driver bacteria Bacteroides a significant association in lesions located in the distal colon with respect to those of the proximal colon. Escherichia coli was significantly associated with proximal colon lesions as was previously described. Escherichia coli also was associated with advanced polyps ( high-grade dysplasia ) , with a well known oncogenic activity. Genus Eubacterium with antioncogenic activity was associated with polyps without dysplasia. The differences observed in bacterial composition between the groups provide new evidence that could contribute to the understanding of the role of the microbiota in colorectal carcinogenesis
Autor/es principal/es: Martín Ibánez, José Juan
Director/es: Conesa Zamora, Pablo
Morán Sánchez, Senador
Trujillo Santos, Antonio Javier
Facultad/Departamentos/Servicios: Escuela Internacional de Doctorado
Forma parte de: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/62619
Tipo de documento: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Número páginas / Extensión: 194
Derechos: info:eu-repo/semantics/openAccess
Aparece en las colecciones:Ciencias de la Salud

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