Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/60684

Title: Impacto de la acetilacion de CRP sobre el metabolismo de Escherichia coli
Issue Date: 31-Jul-2018
Date of creation: 25-Jul-2018
Publisher: Universidad de Murcia
Related subjects: CDU::5 - Ciencias puras y naturales::57 - Biología::577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
Keywords: Enzimas
Abstract: Escherichia coli (E. coli) es una bacteria que actualmente se ha establecido como modelo procariota en estudios de Biotecnología y aplicaciones industriales, por lo que profundizar en los mecanismos involucrados en la regulación de su metabolismo, es clave para optimizar su rendimiento para emplearla como una factoría celular a la carta. Las modificaciones post-traduccionales son una herramienta para controlar dicho metabolismo, siendo la acetilación la que más importancia ha cobrado en los últimos años por ser muy abundante y estar involucrada en gran cantidad de procesos celulares. La proteína reguladora de catabolito (CRP) es un factor de transcripción global de E. coli implicado en multitud de procesos metabólicos, aunque su principal función consiste en controlar la “represión catabólica por carbono” (RCC). Esta proteína necesita unir AMPc para su activación, llevando a cabo la transcripción de los genes que controla y que se clasifican como “promotores dependientes de CRP de tipo I, de tipo II o de tipo III”. Además, CRP se encuentra modificado por acetilación en varias de sus lisinas, aunque el foco de este trabajo se ha centrado en el estudio de la K152, K166 y K100, siendo la última la más interesante por estar involucrada en la interacción directa con la ARN Polimerasa en la transcripción de promotores tipo II, a través de su región de activación 2. El objetivo principal de esta tesis doctoral ha sido dilucidar el papel de la acetilación que sufre el factor de transcripción global CRP, con el objetivo de averiguar cuál es la repercusión de esta modificación post-traduccional en la fisiología de E. coli y más concretamente, sobre el nivel de expresión de los genes regulados por dicha proteína. Para alcanzar tal fin, se han llevado a cabo técnicas de Biología Molecular, purificaciones proteicas, caracterización de las proteínas estudiadas, análisis de expresión génica mediante chips de ADN y RT-qPCR, y análisis de la interacción proteína-proteína mediante la técnica de cambio en la movilidad electroforética (EMSA) y de trascripción in vitro. Los estudios de fisiología bacteriana en distintas fuentes de carbono demostraron que la acetilación de las lisinas 152 y 166 solamente es evidente en acetato, mientras que la acetilación de la lisina 100 de CRP dependió del sustrato empleado, demostrando su mayor impacto en el metabolismo. Así, la purificación y caracterización de las proteínas simulando un estado de acetilación constante (CRP K100Q) y de desacetilación permanente (CRP K100R), demostraron que ambas presentaban una estabilidad muy similar y que la acetilación de la lisina 100 no alteró las propiedades conformacionales de las mismas. Los resultados del transcriptoma global de cepas mutantes de E. coli en glucosa y acetato como fuente de carbono, bajo la influencia de la acetilación/desacetilación de la lisina 100, corroboraron que la acetilación de dicho residuo provoca una disminución de la expresión génica, mientras que el estado de desacetilación aumenta la transcripción de los promotores de tipo II. Así, los resultados derivados del análisis de la transcripción in vitro de los promotores fepA y gatY a partir de la acetilación/desacetilación de la K100 de CRP, permitieron concluir que dicha alteración supone un claro perjuicio en la interacción proteína-proteína con la ARN Polimerasa durante la transcripción. Además, la posición relativa de CRP con la ARN Polimerasa afecta a la tasa transcripcional de los promotores que controla, demostrando que distancias cortas impiden el proceso de transcripción por impedimento estérico y que la más adecuada es la que aporta el promotor semisintético CC(-41,5)D4. Las principales conclusiones extraídas en esta tesis han revelado que el estado de acetilación de E. coli es totalmente dependiente de la fuente de carbono y la fase de crecimiento bacteriano. Además, la acetilación de la lisina 100 de CRP, provoca severas repercusiones en la fisiología bacteriana y en la expresión génica, provocando una disminución en los niveles de expresión génica de aquellos genes controlados por promotores tipo II. Así, las diferencias observadas en la expresión génica en función del estado de acetilación de CRP, vienen derivadas de la peor interacción CRP-ARN Polimerasa durante el proceso de transcripción, como consecuencia del perjuicio provocado por la modificación por acetilación al eliminar la carga positiva que aporta la lisina 100. Escherichia coli is a bacterium that has been established as a prokaryotic model in the area of Biotechnology and for industrial applications. Therefore, discovering the mechanisms involved in the regulation of the E. coli metabolism will contribute to the use of this microorganism as an on demand cellular factory. The prokaryotes metabolism can be regulated by post-translational modifications. Thus, many investigations have focused on acetylation as one of the most important post-translational modifications, which have been found is widely involved in several cellular processes. The catabolite regulator protein (CRP) is a global transcription factor of E. coli involved in controlling the "catabolic repression by carbon source" (RCC). CRP needs to bind cAMP to carry out activation of genic expression. Genes controlled by CRP can be classified as "CRP-dependent promoters of type I, type II or type III". Additionally, CRP is modified by acetylation in several lysines, although this thesis has focused on studying K152, K166 and K100. Particularly, K100 is the most interesting because it is involved in the direct interaction with RNA Polymerase through the Activating Region 2 in the transcription of type II promoters. The main objective of this thesis was to elucidate the role of CRP acetylation and ascertain how this post-translational modification affects the physiology of E. coli and, more specifically, the genes regulated by CRP. To achieve this goal Molecular Biology techniques, protein purifications, protein characterization, gene expression analysis by microarrays and RT-qPCR, study of the protein-protein interaction through electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and in vitro transcription to, it has been used. Study of the E. coli physiology studies in different carbon sources showed differences in lysines acetylation. Thus, the acetylation of lysines 152 and 166 only seems to be evident when acetate is used as the carbon source, while the acetylation of lysine 100 depended on the carbon source considered. For this reason, the major impact of lysine 100 on the metabolism of E. coli was demonstrated. Proteins simulating acetylated (CRP K100Q) and deacetylated (CRP K100R) states were purified and characterized, and both of them showed similar thermodynamic parameters, leading to conclude that the acetylation of lysine 100 did not alter their stability. Global transcriptome analysis of E. coli K100 mutants growing in glucose or acetate as carbon source, demonstrated that the acetylation of lysine 100 is detrimental to gene expression, while the deacetylation state seems to be the most beneficial for the transcription of type II promoters. In vitro transcription analysis using fepA and gatY promoters showed a worse interaction between CRP and RNA Polymerase, which is caused by the acetylation of lysine 100 in CRP. This way, the damage produced in the transcriptional rate by the acetylation of the lysine 100 of CRP was corroborated. In addition, the importance of the distance between the location of CRP and RNA Polymerase in DNA was studied. The results showed that the transcription did not occur in cases where the distance between CRP and RNA Polymerase was smaller due to steric hindrance, while the optimal distance between CRP and RNA Polymerase is provided by the semisynthetic promoter CC(-41,5)D4. The main conclusions of this thesis are: the E. coli acetylation state is totally dependent on the carbon source and culture stage, which is reflected in the number and diversity of lysines acetylated in CRP in the considered conditions. Also, the acetylation of lysine 100 seems to have important repercussions for bacterial physiology and gene expression. The E. coli transcriptome analysis under the influence of CRP acetylation enabled us to understand the role of acetylation in lysine 100 of CRP, which diminishes gene expression levels of type II promoters. The gene expression differences observed, as a function of the acetylation state of CRP, are due to the worse CRP-RNA Polymerase interaction during the transcription, as a consequence of the damage caused by eliminating the positive charge provided by lysine 100 when acetylation occurs.
Primary author: Écija Conesa, Ana
Director: Diego Puente, Teresa de
Cánovas Días, Manuel
Faculty / Departments / Services: Escuela Internacional de Doctorado
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/60684
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 266
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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