Rol de los fitoprostanos y fitofuranos en los mecanismos de protección y de defensa de plantas de arroz (Oryza sativa L.) frente al estrés oxidativo causado por agentes abióticos y prácticas tecnológicas

Abstract

El arroz desempeña un papel fundamental para la seguridad alimentaria de más de la mitad de la población mundial. Al menos el 60% de los suelos cultivados tienen limitacionesde estrés abiótico causadas por deficiencias minerales, temperaturas, extremas, sequía o acidez. Prácticas tecnológicas específicas pueden contribuir a disminuir los daños. Los fitoprostanos (FPs) y fitofuranos (FFs) producidos a través de reacciones de oxidación no enzimática del ácido linolénico de las membranas vegetales, son capaces de protegerlas células los efectos nocivos derivados del estrés oxidativo. En este marco, la presente tesis propone estudiar el perfil y contenido de FPs y FFs en arroz blanco, integral y salvado de arroz, en diferentes genotipos, así como su rol en los mecanismos de protección y defensa contra el estrés oxidativo causado por agentes abióticos y diferentes prácticas tecnológicas. Con el fin de comprender los niveles de estrés oxidativo inducido por las prácticas agronómicas específicas, se establecieron 3 ensayos durante las estaciones de crecimiento (Octubre-2015/Abril-2016 y Octubre-2016/Abril-2017), en un campo experimental, en el centro-este de Argentina, perteneciente a la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales de la Universidad Nacional de La Plata (34˚52’S, 57˚57’W, 9.8 m de altitud). El diseño experimental consistió, en todos los casos, en bloques al azar con 3 repeticiones. En el primer ensayo se analizaron las harinas de grano pulido, integral y salvado de arroz de 14 variedades. El segundo ensayo consistió en la siembra de 1 variedad control, y 4 genotipos de elevado contenido proteico en grano; los tratamientos fueron 0 y 0,3 Lha-1 de fertilizante foliar (solución de micronutrientes). En el tercer ensayo se sembraron 7 genotipos. Los tratamientos fueron dos ambientes (campo abierto y cubierta plástica) y pulverizaciones de acido salicílico en dosis de 0, 1 y 15 mM. Los granos se molieron y tamizaron. La preparación y adecuación de las muestras se realizó mediante extracción en fase sólida y su análisis cuali-cuantitativo utilizando UHPLC-ESI-QqQ-MS/MS. Las diferencias estadísticas se obtuvieron efectuando análisis de varianza multifactorial o de una vía (ANOVA) y las medias se compararon utilizando el test de Tukey. Los FPs y FFs analizados fueron: 9-F1t-PhytoP; Ent-16-F1t-PhytoP + Ent-16-epi-16-F1t-PhytoP; 9-epi-9-F1t-PhytoP; 9-epi-9-D1t-PhytoP; 9-D1t-PhytoP; Ent- 16-B1-PhytoP + 16-B1-PhytoP; Ent-9-L1-PhytoP + 9-L1-PhytoP; Ent-16-(RS)-9-epi-ST-Δ14-10-PhytoF; Ent-9-(RS)-12-epi-ST-Δ10-13-PhytoF y Ent-16-(RS)-13-epi-ST-Δ14-9-PhytoF. La implementación de los ensayos y la metodología indicada permitieron obtener los siguientes resultados: 1) En relación con el impacto del proceso tecnológico de la obtención de harinas de arroz sobre los niveles de FPs y FFs, se observó que, para ambos grupos, las concentraciones promedio fueron más altas en el salvado de arroz que en las harinas de grano pulido e integral. Las concentraciones recuperadas sugieren que el salvado de arroz es una valiosa fuente dietética de FPs y FFs que debería considerarse en estudios adicionales sobre biodisponibilidad y bioactividad in vitro e in vivo. 2) Al analizar el impacto de la fertilización foliar sobre el contenido de FPs y FFs totales, se encontraron efectos significativos. La abundancia relativa de FPs promedio de los tratamientos y los genotipos resultó entre 213,3 y 3,1 ng g-1 ms; mientras que en los FFs fue entre 19,2 y 3,5 ng g-1ms. El contenido total de FPs y FFs disminuyó un 31,9% y un 20,0% respectivamente con el tratamiento de fertilización foliar. 3) Finalmente, con respecto al efecto de los diferentes ambientes y la aplicación de ácido salicílico se observó que ambos tratamientos produjeron una reducción de la concentración de los biomarcadores dependiente de los compuestos y genotipos estudiados. Rice plays a key role in food safety of more than half of the world's population. At least 60% of cultivated soils have abiotic stress limitations caused by mineral deficiencies, temperatures, extremes, drought or acidity. Specific technological practices can help to reduce the damage. The phytoprostanes (FPs) and phytofurans (FFs) produced by the non-enzymatic oxidation of the linolenic acid present in the plant membranes and participate in the protection of cells and tissues against the deleterious effects of oxidative stress. Thus, the present Thesis is aimed at studying the profile and content of FPs and FFs in white rice, whole rice and rice bran, in different genotypes, as well as its role in the protection and defense mechanisms against oxidative stress caused by abiotic agents and diverse technological practices. In order to understand the levels of oxidative stress induced by specific agronomic practices, three (3) trials were established during the growing season (October-2015/April-2016 and October-2016/April-2017), in an experimental field, in the Mid-East of Argentina, belonging to the Faculty of Agricultural Sciences and Forestry of the National University of La Plata (34˚ 52’S, 57˚ 57’W, 9.8 m of altitude). The experimental design was, in all cases, random blocks with 3 repetitions. In the first trial, polished grain, whole grain and rice bran flours from 14 varieties were analyzed. The grains were ground and sieved. The second trial consisted in sowing 1 control variety, and 4 genotypes of high protein content in grain; treatments were 0 and 0.3 Lha-1 of foliar fertilizer (micronutrient solution). In the third trial, 7 genotypes were sown. The treatments were two environments (open field and plastic cover) and the spray application of three doses of salicylic acid (0, 1, and 15 mM). The extraction and adequacy of the samples was carried out by extraction in solid phase and its qualitative-quantitative analysis by UHPLC-ESI-QqQ-MS / MS. The statistical differences were obtained by means of multivariate or one-way analysis of variance (ANOVA) and the means were compared using the Tukey test. The FPs and FFs analyzed were: 9-F1t-PhytoP; Ent-16-F1t-PhytoP + Ent-16-epi-16-F1t-PhytoP; 9-epi-9-F1t-PhytoP; 9-epi-9-D1t-PhytoP; 9-D1t-PhytoP; Ent- 16-B1-PhytoP + 16-B1-PhytoP; Ent-9-L1-PhytoP + 9-L1-PhytoP; Ent-16-(RS)-9-epi-ST-Δ14-10-PhytoF; Ent-9-(RS)-12-epi-ST-Δ10-13-PhytoF y Ent-16-(RS)-13-epi-ST-Δ14-9-PhytoF. The implementation of the tests and the indicated methodology allowed obtaining the following results: 1) Regarding the impact of the technological process developed to obtain rice flours on the levels of FPs and FFs, it was observed that both classes of compounds exhibited average concentrations higher in the rice bran than in the brown grain flour and white grain flours. The recovered concentrations suggested that rice bran is a valuable dietary source of FPs and FFs that should be considered in further studies on bioavailability and bioactivity in vitro and in vivo. 2) When analyzing the impact of foliar fertilization on the content of FPs and total FFs, significant effects were found. The relative abundance of average FPs of the treatments and genotypes was between 213.3 and 3.1 ng g-1dw; while in the FFs, it was between 19.2and 3.5 ng g-1 dw. With the foliar fertilization treatment, the total content of FPs and FFs decreased by 31.9% and 20.0%, respectively. 3) Finally, regarding the effect of the different environments and the application of salicylic acid, it was observed that both treatments produced a reduction in the concentration of the biomarkers, differential according to the compounds and genotypes.