Metabolismo del acetato en Escherichia coli : caracterización y regulación

Abstract

Escherichia coli (E.coli) es una bacteria Gram-negativa que posee una serie de características que la han convertido en el principal modelo procariota en biología y biotecnología. El licopeno es un terpeno de gran interés industrial que posee diversas aplicaciones, aunque hasta el momento no se ha desarrollado un método de producción que pueda competir con la extracción a partir de tomates. A pesar de las muchas ventajas que presenta E. coli a nivel biotecnológico, también presenta ciertas desventajas. La principal de estas desventajas es la excreción de acetato en cultivos suplementados con glucosa como fuente de carbono. Por otro lado, las modificaciones post-traduccionales, como la N-ɛ acetilación de lisinas, son esenciales para comprender la regulación metabólica de todos los organismos. En E. coli, el metabolismo del acetato se encuentra íntimamente ligado a las modificaciones post-traduccionales por acetilación de lisinas a través de las concentraciones de acetil-CoA y acetil-fosfato, y de la regulación de la proteína acetil-CoA sintetasa (Acs). El objetivo principal de esta tesis doctoral fue avanzar en el conocimiento del metabolismo del acetato de E. coli y en su regulación por acetilación/desacetilación de lisinas A continuación se resumen los principales resultados obtenidos: En el capítulo 3 de esta tesis se ha llevado a cabo el desarrollo de un método de sobreproducción y extracción continua de licopeno con un sistema bifásico, empleando cepas de E. coli modificadas genéticamente. De esta manera, se ha conseguido una producción ampliamente superior a la obtenida con los métodos tradicionales. Por último, los resultados obtenidos en este capítulo corroboran el potencial de E. coli en el campo biotecnológico. El capítulo 4 de esta tesis se ha centrado en la caracterización bioquímica y biofísica de la acetiltransferasa PatZ. Se ha caracterizado cinéticamente la acetilación de la proteína Acs por PatZ por primera vez y se ha demostrado la autoacetilación reversible de PatZ La sirtuína CobB, principal desacetilasa de E.coli, ha sido caracterizada bioquímicamente en el capítulo 5 de esta tesis doctoral. Se ha estudiado cinéticamente la desacetilación de la proteína Acs por CobB y su inhibición por nicotinamida, estableciéndose un mecanismo de inhibición no competitivo. El capítulo 6 de esta tesis se centra en el estudio de la etapa de adenilación del mecanismo catalítico de la proteína Acs. Se ha llevado a cabo la caracterización cinética y termodinámica, respecto a la unión de ATP, de cuatro proteínas mutantes y de la proteína Acs nativa, desacetilada y acetilada. Los resultados han demostrado la importancia de los residuos estudiados en la capacidad catalítica y en la afinidad de Acs por ATP. En el capítulo 7 se ha estudiado la influencia del tipo de fuente de carbono y nitrógeno sobre distintos aspectos relacionados con el metabolismo del acetato en E. coli. Se han observado importantes diferencias en algunos de los parámetros fisiológicos determinados, así como en la excreción de acetato, y se ha determinado, por primera vez, el pH intracelular de forma continua para una bacteria en un cultivo. Finalmente, las principales conclusiones que podemos extraer de esta tesis doctoral son: 1) Se ha construido un sistema competitivo de producción de licopeno empleando cepas de E. coli modificadas genéticamente; 2) El estado oligomérico de PatZ está regulado por autoacetilación/desacetilación; 3) Acs es desacetilada por CobB en varias lisinas con una cinética monofásica; 4) La lisina 609 de Acs tiene un papel fundamental en la unión de la proteína a ATP y 5) La fuente de carbono y nitrógeno tiene una gran influencia en la fisiología y el control del pH intracelular de E. coli. Escherichia coli (E. coli) is a Gram-negative bacterium with several characteristics that have made it a global model in biology and biotechnology. Lycopene is an important terpenoid with several applications, although most of lycopene is obtained from tomato. In spite of the great advantages of E. coli in the biotechnology field, it has also some disadvantages. The main E. coli biotechnological drawback is the excretion of acetate in cultures supplemented with glucose as carbon source. For this, much effort has been put into deepening our knowledge of the acetate metabolism with the purpose of minimizing E. coli acetate overflow. By other way, post-translational modifications, such as N-ɛ lysine acetylation, are essential to know metabolism regulation in all the organisms. E. coli acetate metabolism is closely related to post-translational modifications by lysine acetylation through acetyl-phosphate and acetyl-CoA pools and acetyl-CoA synthetase (Acs) regulation by lysine acetylation. The main objective of this PhD thesis was to advance into the E. coli acetate metabolism knowledge and regulation by lysine acetylation/deacetylation. The main results of this PhD thesis are summarized below. In chapter 3 of this thesis a lycopene overproduction and continuous biphasic extraction system employing E. coli strains modified by genetic engineering has been developed. The results obtained in this chapter corroborate the potential role of E. coli in biotechnology field. Chapter 4 of this dissertation is focused on acetyltransferase PatZ biochemical characterization. The kinetics of Acs acetylation by PatZ have been characterized for the first time, and PatZ reversible autoacetylation has been described. In chapter 5, CobB sirtuin kinetics of Acs deacetylation have been characterized. Moreover, CobB inhibition by nicotinamide has been studied and a non-competitive inhibition mechanism was established. The chapter 6 of this dissertation is focused on the adenylating catalytic step of Acs protein. Kinetics and ATP binding calorimetric parameters were determined for the four mutant proteins and for Acs native protein, in the acetylated and deacetylated state. The results showed the important role of the selected residues in the catalytic and affinity Acs parameters. In chapter 7 of this thesis, the influence of carbon and nitrogen sources on E. coli acetate metabolism was evaluated. The E. coli acetate metabolism was studied for E. coli wt and five deficient strains. As regards physiological parameters and acetate excretion determined, several differences were observed depending on the culture medium and strains. Intracellular pH was determined for the first time in E. coli and important results were achieved. Finally, the main conclusions we can extract are: 1) A competitive lycopene production system using E. coli strains modified by genetic engineering has been developed; 2) PatZ oligomeric state is regulated by autoacetylation/deacetylation; 3) Acs is deacetylated by CobB in several lysines with monophasic kinetics; 4) Acs lysine 609 has an important role in Acs ATP-binding and 5) Carbon and nitrogen sources have a great influence on E. coli physiology and intracellular pH control.