Mejora de la eficiencia de tecnologías embrionarias porcinas

Abstract

Objetivos: El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue la optimización de dos tecnologías embrionarias en la especie porcina, la producción in vitro de embriones y la transferencia de embriones, mediante el estudio y evaluación de distintos factores que afectan directamente a su eficiencia y aplicabilidad. Para ello, en una primera fase nos centramos en el estudio del aceite mineral (MO) utilizado para cubrir los medios de cultivo en los sistemas de producción in vitro de embriones, lo cual también es aplicable al cultivo de embriones producidos in vivo. En una segunda fase, se estudiaron determinados factores que afectan a la eficiencia de la transferencia de embriones, incluyendo 1) la efectividad de la transferencia quirúrgica y no quirúrgica de embriones vitrificados; 2) la adecuación de un medio químicamente definido y con pH estable como medio básico para la vitrificación y el calentamiento de los embriones; 3) el desarrollo de un procedimiento de conservación de embriones en estado líquido y en ausencia de CO2; y 4) los efectos de los procedimientos para la obtención quirúrgica de embriones y para la transferencia no quirúrgica sobre el futuro reproductivo de las cerdas donantes y receptoras, respectivamente. Métodos: Se han utilizado protocolos establecidos tanto para la PIV de embriones como para la vitrificación y calentamiento de los mismos. Para la conservación embrionaria en estado líquido, los embriones en estadio de mórula se lavaron 10 veces e inmediatamente se conservaron a diferentes temperaturas y en diferentes medios, según el diseño experimental, por un periodo de hasta 72 h. Tras el periodo de conservación, los embriones se cultivaron de forma convencional para evaluar su potencial de desarrollo in vitro o se transfirieron a cerdas receptoras. Para la obtención quirúrgica de embriones y para las transferencias quirúrgicas y no quirúrgicas se han utilizado técnicas puestas a punto por nuestro laboratorio en años anteriores. Conclusiones: Las principales conclusiones de esta Tesis Doctoral son: 1.- A pesar de su pronunciado impacto sobre los niveles de progesterona en el medio de maduración, el uso aceite mineral para cubrir los medios de maduración, fecundación y cultivo embrionario no afecta el patrón de la maduración ni la capacidad de desarrollo in vitro de los ovocitos. 2.- El uso de una cubierta de aceite mineral peroxidado disminuye drásticamente los resultados de la producción in vitro de embriones. Dicha disminución se asocia a los elevados niveles de peróxidos en el aceite, pero no puede explicarse por los niveles de peróxido de hidrógeno ni de especies de oxígeno reactivo transferidas desde el aceite a los medios de cultivo. 3.- El tipo de aceite mineral usado durante la maduración, fecundación y cultivo embrionario afecta a la producción in vitro de embriones, debido, probablemente, a diferencias entre los aceites en la composición de compuestos orgánicos volátiles y en la transferencia de compuestos a los medios de incubación. 4.- La tasa de parto y el tamaño de la camada de las cerdas receptoras sometidas a una trasferencia no quirúrgica de embriones aumentan al aumentar el número de embriones vitrificados transferidos por receptora, llegando a obtenerse una fertilidad similar a cuando se emplea la transferencia quirúrgica. 5.- La vitrificación y el calentamiento embrionario usando un medio químicamente definido y pH estable como medio basal asegura un excelente potencial de desarrollo in vitro y una adecuada fertilidad tras la transferencia quirúrgica de los embriones vitrificados en los estadios de mórula y blastocisto. 6.- Las mórulas conservadas a 37ºC en un medio semi-definido que contenga albúmina sérica bovina mantienen su viabilidad in vitro y su capacidad de desarrollo por un periodo de 72 h. Esos embriones son capaces de desarrollarse en fetos normales al menos hasta el día 38 de gestación. 7.- La obtención quirúrgica de embriones compromete el futuro reproductivo de las cerdas donantes. Por contra, la técnica de transferencia no quirúrgica de embriones no afecta el potencial reproductivo de las cerdas receptoras tras su reintroducción como reproductoras de la granja. Objectives: The general objective of this doctoral thesis is the optimization of two porcine embryonic technologies, in vitro embryo production and embryo transfer, through the study and evaluation of different factors that directly affect their efficiency and applicability. For this porpuse, in a first phase we focused on the study of mineral oil (MO) used to cover the drops of culture media in in vitro embryo production systems, which is also applicable to the culture of in vivo produced embryos. In a second phase, we studied factors that affect the efficiency of embryo transfer, including 1) the effectiveness of the surgical and non-surgical transfer of vitrified embryos; 2) the adequacy of a chemically defined medium with a stable pH for vitrification and embryo warming; 3) the development of an embryo storage procedure in liquid state and in the absence of CO2; and 4) the effects of surgical embryo collection and non-surgical embryo transfer on the reproductive future of the donor and recipient sows, respectively. Methods: Already established methods for the in vitro embryo production and vitrification were used. For embryonic conservation in a liquid state, embryos in the morula stage were washed 10 times and immediately preserved at different temperatures and in different media, according to the experimental design, for a period of up to 72 h. After the storage period, embryos were cultured conventionally to evaluate their in vitro development potential or transferred to recipient sows. To collect embryos surgically and for surgical and nonsurgical transfers, techniques developed in our laboratory in previous years have been used. Conclusions: 1.- Despite its pronounced impact on progesterone concentration in the maturation medium, the use of mineral oil overlay during maturation, fertilization and embryo culture does not affect the time-course of maturation or the developmental competence of pig oocytes in vitro. 2.- The use of a peroxidized mineral oil overlay dramatically decreases embryo production outcomes. This decrease is associated with the higher peroxide values of the oil but cannot be explained by the levels of hydrogen peroxide and reactive oxygen species transferred from the oil to the culture media. 3.- The type of oil cover used during maturation, fertilization and embryo culture affects porcine embryo production, which can be due to the differences detected in volatile organic compounds composition and compounds transfer into incubation medium between oils. 4.- Farrowing rate and litter size following a nonsurgical deep uterine embryo transfer procedure increase in function of a larger number of transferred vitrified embryos, with fertility equalizing that obtained with the invasive surgical approach. 5.- Vitrification and warming procedures using a chemically defined, pH-stable medium as a basal medium ensure an excellent in vitro developmental potential and an adequate reproductive performance after surgical embryo transfer of embryos vitrified at the morula and blastocyst stages. 6.- Morulae stored at 37ºC in a semi-defined medium containing bovine serum albumin maintain their in vitro viability and developmental competence for up to 72 h. Additionally, these embryos were able to develop into normal fetuses by day 38 of pregnancy. 7.- Surgical embryo collection procedure compromises the reproductive future of donor sows. By contrast, the nonsurgical deep uterine embryo transfer approach does not affect the reproductive potential of the recipients after reintroduction to the breeding stock of the farm.