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Title: Función del mecanismo de doble diana en la regulación de proteínas periféricas de membrana
Other Titles: Dual-targeting implication in the regulation of peripheral membrane proteins
Issue Date: 13-Apr-2018
Date of creation: 24-Jul-2017
Publisher: Universidad de Murcia
Related subjects: CDU::5 - Ciencias puras y naturales::57 - Biología::577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
Keywords: Proteínas
Abstract: OBJETIVOS:  Caracterización del tratamiento basado en la inhibición de la expresión de PKCα en combinación con hiperforina para el cáncer de mama.  Caracterización del tratamiento basado en la inhibición de la expresión de PKCα en combinación con salinomicina para el cáncer de mama.  Validación del análisis del perfil diferencial de transcritos de células de cáncer de mama con inhibición de la expresión de PKCα.  Diseño y estudio del efecto de una terapia combinada basada en la disminución de la expresión de PKCα combinada con fármacos inhibidores de las proteínas sobre-expresadas como consecuencia.  Determinación de rutas de señalización directamente fosforiladas por PKCα en la línea de cáncer de mama MCF-7.  Caracterización de la interacción de Rabfilina3A con SNAP25 en células PC12. MATERIALES Y MÉTODOS: Las diferentes técnicas usadas han sido: 1) Construcción de plásmidos de expresión, 2) Cultivos celulares (MCF-7, MDA-MB-231, PC12), 3) Microscopía confocal y TEM, 4) Ensayos de proliferación, migración y apoptosis, 5) qPCR, 6) Ensayo de ligación por proximidad (PLA), 7) Resonancia de plasmón de superficie, 8) siRNA de interferencia, 9) Inmunofluorescencia, 10) Western-blot, 11) Análisis de imagen (FIJI), 12) Estudio del perfil de fosforilación de quinasas humano. RESULTADOS: Se ha determinado el efecto anti-proliferativo y pro-apoptótico de la hiperforina en las células MDA-MB-231 en presencia y ausencia de PKCα. Solamente la inhibición de PKCα reduce un 20% la capacidad de proliferación de estas células. El tratamiento combinado de hiperforina e inhibición de PKCα consiguen un mejor efecto a una concentración más baja de hiperforina que los obtenidos en presencia de PKCα. Se ha estudiado el efecto de la salinomicina junto con la inhibición de PKCα sobre la capacidad de proliferación y la inducción de procesos como la autofagia y apoptosis, en dos líneas celulares modelo del cáncer de mama como son MCF-7 y MDA-MB-231. Se observó una completa reducción de la capacidad proliferativa con una concentración de 10 mM salinomicina en ambas líneas en presencia y ausencia de PKCα. Se ha validado el estudio del perfil génico mediante qPCR y se ha diseñado una terapia combinada que inhibe la expresión de PKCα y otro de estos genes simultáneamente PLCβ4, PRKA, ERBB4 o PDGFR. Se ha medido la capacidad proliferativa, de migración y la inducción de apoptosis. Los resultados mostraron que el inhibidor BMS 599626 específico para ErbB puede tener un efecto sinérgico con PKCα para tratar el cáncer de mama. Otro aspecto estudiado fue el perfil de fosforilación de quinasas y sus proteínas sustrato que fue esencial para comprender como las células MCF-7 respondían con su entorno a la inhibición de la expresión de PKCα. Se observó una reducción general de los niveles de fosforilación relativos a la situación control, en la familia de proteínas STAT o mTOR entre otras. Nuestro grupo ha resuelto la estructura cristalina del complejo C2B de rabfilina con SNAP25 y el complejo C2B-PIP2 en colaboración con el grupo de Dr. Verdaguer IBMB-CSIC, Barcelona. Se ha llevado a cabo la caracterización biofísica y bioquímica en nuestro laboratorio, determinando que el α-hélice del C2B de rabfilina3A es crucial para interaccionar con SNAP25, mientras que la región polibásica es esencial para la interacción dependiente de los fosfoinosítidos con la membrana plasmática. La interacción de rabfilina3A y SNAP25 fue visualizada y caracterizada con resolución de molécula única en un ensayo de ligación por proximidad in situ (PLA) mediante la expresión transiente de HA-rabfilina3A y myc-SNAP25 en las células PC12. Otro aspecto estudiado fue el papel del C2AB-rabfilina3A en la fusión de membranas dependiente de PIP2 y calcio mediante tinción negativa en vesículas unilamelares pequeñas (POPC/POPS/PIP2) visualizadas con microscopía electrónica de transmisión (TEM). CONCLUSIONES: 1. Se ha demostrado el efecto anti-proliferativo, pro-apoptótico y pro-autofágico de la hiperforina en células de cáncer de mama MDA-MB-231. 2. La inhibición de la expresión de PKCα en combinación con el tratamiento de hiperforina consigue alcanzar una reducción total de la capacidad proliferativa de las células MDA-MB-231 3. La salinomicina es capaz de inhibir la capacidad proliferativa, incrementar los niveles de apoptosis y de síntesis de proteínas marcadoras de autofagia como es LC3B en las líneas celulares de mama MCF-7 y MDA-MB-231. 4. Los efectos de salinomicina sobre estas células pueden ser mejorados cuando se inhibe la expresión de PKCα, pudiendo bajar la dosis empleada de salinomicina y por tanto la toxicidad del tratamiento. 5. Se ha validado mediante qPCR el silenciamiento de PKCα mediante siRNA en las células MCF-7, así como la sub-expresión de los genes EGFR e ITGB6 apoyando así los resultados obtenidos por el microarray. 6. El uso de inhibidores específicos de las proteínas (PLCβ4, PKA, ErbB4 y PDGFR), cuyos genes habían resultado sobre-expresados en el microarray debido a la ausencia de PKCα, confirmaron nuestra hipótesis de un posible efecto sinérgico en la capacidad proliferativa, de migración y apoptosis cuando se combina con la inhibición de la expresión de PKCα. 7. El silenciamiento de PKCα provoca una disminución general en los niveles de fosforilación relativa a diferentes familias de quinasas estudiadas: la familia proteínas STAT, la quinasa de adhesión focal (FAK), mTOR, HSP60, PRAS40 y dos aumentos de los niveles de fosforilación que son ERK1/2 y p53. 8. Se confirmaron los residuos implicados en la interacción de rabfilina3A con SNAP25. Los residuos de rabfilina3A se encuentran en el α-hélice del dominio C2B y son K651A/K656A/K663A/H617A y los residuos de SNAP25 son E38A/D41A/R45A y están en el extremo N-terminal. Esto se determinó mediante ensayos de ligación por proximidad (PLA) en células PC12. 9. También se confirmó que la interacción de rabfilina3A y SNAP25 es un mecanismo dependiente de la unión a PIP2 a través del tándem C2AB de rabfilina mediante la misma técnica de PLA. 10. Se caracterizó in vitro la interacción mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR) permitiendo calcular la constante de disociación KD = 1 µM. 11. Además, se demostró que el C2AB de rabfilina3A tiene efecto sobre la curvatura y fusión de membranas lipídicas (SUV) dependiente de la unión a PIP2 y a Ca2+ mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). OBJECTIVES:  Characterization of the hyperforin treatment of breast cancer cells in the presence and absence of PKCα expression.  Characterization of the salinomycin treatment of breast cancer cells in the presence and absence of PKCα expression.  Validation of the analysis of differential gene expression profiles of a model breast cancer cell line (MCF-7) in the presence and absence of PKCα.  Therapy design based on the molecular markers obtained in the analysis of differential gene expression.  Characterization the phosphorilation pathways affected under the control of PKCα on the breast cancer cell line MCF-7.  Characterization of the Rabphilin-3A and SNAP25 interaction on PC12 cells. MATERIALS AND METHODS: The different techniques required were: 1) Construction of expression plasmids, 2) Cell culture (MCF-7, MDA-MB-231, PC12), 3) Confocal microscopy and TEM, 4) Proliferation, Migration and Apoptosis measurements, 5) qPCR, 6) Proximity Ligation Assay (PLA), 7) Surface Plasmon Resonance, 8) siRNA interference, 9) Immunofluorescence, 10) Western-blot, 11) Image analysis (FIJI), 12) Human Phospho-Kinase Array. RESULTS We have determined the anti-proliferative and pro-apoptotic effect of hyperforin in MDA-MB-231 cells in the presence and absence of PKCα. Only the absence of PKCα reduced 20% the proliferation capacity of these cells. Hyperforin and the inhibition of PKCα together achieved a better effect with a lower concentration of hyperforin than in the presence of PKCα. We have studied the effect of salinomycin treatment with down-regulated PKCα on the proliferation capacity and on process like autophagy and apoptosis of two characteristics of malignant cancer cells, MCF-7 and MDA-MB-231 cells. The results obtained in proliferation assays determined a completed reduction of this capacity with 10 μM of salinomycin in both breast cancer cell lines under the presence or the absence of PKCα expression. We validated these results by qPCR and designed a therapy that combines to inhibit PKCα expression and other of these PLCβ4, PRKA, ERBB4 or PDGFR simultaneously. We studied this therapy through proliferation and migration capacity and the effect on apoptosis. The results obtained showed that BMS 599626 inhibitor, which is against ErbB proteins, might be a synergistic collaborator with PKCα to treat breast cancer. Another aspect studied was analyze the phosphorylation profile of kinases and their protein substrates and was essential for understanding how MCF-7 cells respond to changes in their environment like the inhibition of PKCα expression. We obtained a general reduction of the phosphorylation levels, STAT family and mTOR among others. Our group has resolved the crystal structures of Rph3A C2B-SNAP25 and C2B-PIP2 complexes in collaboration with the group of Dr. Verdaguer IBMB-CSIC, Barcelona. Biophysical and biochemical characterization performed in our group indicated that the bottom α-helix of C2B domain of rabphilin3A is crucial to interact with SNAP25, while the polybasic region is essential for the phosphoinositide-dependent interaction with the plasma membrane. The Raphilin3A and SNAP25 interactions were visualized at single-molecule resolution in an in situ proximity ligation assay (PLA) by a transient expression of the full-length HA-Rph3A and myc-SNAP25 in PC12 cells. Another aspect studied was the role in the membrane fusion of C2AB-Rph3A with small unilamellar vesicles (POPC/POPS/PIP2) and negative staining by transmission electron microscopy in a PIP2 and calcium dependent manner. CONCLUSIONS: 1. Hyperforin treatment shows an anti-proliferative and pro-apoptotic effect, and hyperforin also increases the synthesis of autophagic marker protein LC3B on MDA-MB-231 breast cancer cell line. 2. PKCα expression inhibition with hyperforin treatment achieves to completely reduce the proliferation rate of MDA-MB-231 cells. The hyperforin pro-apoptotic and pro-autophagic effect is independent of the presence and the absence of PKCα. 3. Salinomycin treatment inhibits the proliferation rate, to induce apoptosis and increase autophagic protein synthesis marker LC3B on MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines. 4. PKCα down-regulation improves the salinomycin effect; this absence achieves better and faster results with a lower salinomycin dosis and this combination gives rise to a low toxicity treatment. 5. siRNA PKCα inhibition used for gen expression profile microarray of MCF-7 cells is validated by qPCR, and the down-regulation of EGFR and ITGB6 genes obtained in microarray analysis too. 6. The combination of PKCα down-regulation and specific inhibitors used against key up-regulated microarray genes (PLCβ4, PKA, ErbB4 y PDGFR) obtained in the absence of PKCα, confirm our synergistic effect hypothesis on the proliferation rate, migration capacity and apoptosis in MCF-7 cells. 7. PKCα down-regulation reduce the relative levels of the phosphorilation protein families studied, mainly STAT protein family, FAK, mTOR, HSP60, PRAS4 and only two protein families are increased: ERK1/2 and p53. 8. We confirme residues implicated in the rabphilin3A and SNAP25 interaction. These residues belong to the α-helix C2B bottom face of rabphilin3A are K651A/K656A/K663A/H617A and E38A/D41A/R45A at N-terminal position of SNAP25. 9. The Rabphilin3A and SNAP25 interaction mechanism needs to bind PIP2 and this happen through C2AB of rabphilin3A. 10. We characterize in vitro rabphilin3A and SNAP25 interaction by surface plasmon resonance (SPR) measuring the dissociation constant of KD = 1 µM. 11. C2AB-rabphilin3A shows to be involved in the membrane phusion and curvature of the small unilamellar vesicules (SUV) in a PIP2/Ca2+-dependent manner by negative staining with transmission electron microscopy (TEM).
Primary author: Coronado Parra, María Teresa
Director: Corbalán García, Senena
Gómez Fernández, Juan Carmelo
Faculty / Departments / Services: Facultad de Biología
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/57700
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 213
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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