Estudio de la función del gen DOCK10, inducible por IL-4 en linfocitos B, como factor de intercambio de nucleótidos de guanina y de los perfiles de expresión génica y microRNA en leucemias linfocíticas crónicas tratadas con IL-4 in vitro

Abstract

En estudios previos, nuestro grupo identificó a DOCK10 como un gen cuya expresión se induce por IL-4 en linfocitos B normales (LBN) y en leucemias linfocíticas crónicas (LLC). Dada su pertenencia a la familia de proteínas DOCK, se sugiere un posible papel como regulador de las GTPasas Rho. En la publicación 1 tratamos de responder algunas preguntas esenciales sobre la función de DOCK10, tales como: (1) su especificidad para interaccionar con las GTPasas Rho “clásicas”, que abordamos mediante la realización de ensayos “pulldown” tras transfección transitoria en la línea celular 293T; (2) su papel potencial como GEF activador de estas proteínas, que también abordamos mediante ensayos “pulldown” pero realizados en este caso en un sistema de clones con expresión estable e inducible generado en la línea celular HeLa; y (3) su papel en la morfología celular, dinámica del citoesqueleto de actina y protrusiones de membrana mediante microscopía de fluorescencia en este mismo sistema. Pudimos demostrar que las isoformas de primer exón mutuamente excluyente DOCK10.1 y DOCK10.2 interaccionan in vitro de forma específica con las GTPasas Cdc42 y Rac1 en condición libre de carga de nucleótido y que DOCK10.1 incrementa los niveles de activación de ambas GTPasas. DOCK10.1 induce la transición desde una forma elongada y poligonal, hasta una forma más redondeada, no poligonal, con incremento de filopodios y ondulaciones de membrana, cambios compatibles con la activación de dichas GTPasasLa patogenia de la LLC es poco conocida, y la IL-4, como factor de crecimiento de los linfocitos B, podría jugar un papel. La IL-4 ejerce un papel anti-apoptótico en la LLC, y algunos estudios sugieren la hipótesis de que podría jugar un papel oncogénico. Puesto que una parte importante de la acción de la IL-4 es muy probablemente ejercida a través de cambios inducidos en la expresión génica, y ésta no ha sido suficientemente estudiada en LBN y LLC, planteamos un análisis mediante microarrays en ambos tipos celulares (publicación 2). La IL-4 regula la expresión de al menos 229 genes, 189 en LLC y 123 en LBN, siendo 89 comunes, la mayoría inducidos, y con mayor diferencia que los genes reprimidos, y también mayor intensidad en LLC, sugiriendo que esta ruta es muy activa en esta patología. La mayoría de estos genes no eran dianas conocidas de la IL-4. Además la respuesta génica a la IL-4 es diferente en función de la expresión del factor pronóstico ZAP-70, a través de un mecanismo que implica al factor de transcripción NFκB. También identificamos genes que se correlacionan con la protección anti-apoptótica, tales como HOMER2 y BCL6. En la publicación 3 estudiamos mediante microarrays la respuesta a la IL-4 de un tipo de genes no convencionales denominados miRNAs, importantes en la regulación de laexpresión proteica. Identificamos 8 miRNAs maduros, miR-21 (5p y 3p), miR-362 (3p y 5p), miR-500a-3p, miR-502-3p, y miR-532 (3p y 5p), que se inducen por la IL-4 en LLC, y esto ocurre probablemente por un mecanismo “pasivo”, siendo miR-21 intragénico a VMP1, el resto de miRNAs intragénicos a CLCN5, y ambos genes inducidos por la IL-4, de modo que los miRNAs se inducirían incrustados dentro de los tránscritos primarios de ambos. Puesto que la IL-4 juega un papel crucial en la evasión de la apoptosis y la resistencia a quimioterapia, la identificación de los genes y miRNAs regulados por la IL-4 contribuiría a un mayor esclarecimiento de los mecanismos moleculares de la señalización por la IL-4, lo que podría aprovecharse para buscar alternativas terapéuticas mediante la manipulación de esta vía, con inhibidores específicos o con nuevos abordajes más experimentales como el empleo de miRNAs.