Antioxidantes del plasma seminal : potenciales biomarcadores de fertilidad en verracos incluidos en programas de inseminación artificial

Abstract

La Tesis Doctoral, presentada por compendio de publicaciones y estructurada en 5 artículos científicos, tuvo como principal objetivo determinar componentes del plasma seminal (PS) de porcino con propiedades antioxidantes y evaluar su valor predictivo para la calidad y funcionalidad espermática y la fertilidad de verracos incluidos en programas de inseminación artificial (IA). Concretamente, se evaluó la capacidad antioxidante total (TAC, artículo1), las enzimas paraoxonasa tipo 1 (PON-1, artículo 2 y 3) y glutatión peroxidasa 5 (GPX5, artículo 4), y la melatonina (MLT, artículo 5). Para llevar a cabo los estudios se utilizaron 821 eyaculados, procesados de forma entera o fraccionada, procedentes de 440 verracos y un total de 16.942 cerdas fueron inseminadas. Las muestras de PS fueron obtenidas inmediatamente después de la recogida de los eyaculados, mediante una doble centrifugación a 1.500 xg durante 10 min y almacenadas a -80 ºC hasta el momento de su análisis. La TAC y la actividad de PON-1 fueron determinadas usando un analizador automatizado, evaluando la decoloración del 2,2'-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato) y midiendo la hidrólisis del p-nitrofenil acetato a p-nitrofenol, respectivamente. La concentración de PON-1, GPX5 y MLT fueron determinadas usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante y usando un lector de placas. La motilidad espermática fue evaluada mediante un sistema de análisis espermático computarizado. La viabilidad espermática y los parámetros de funcionalidad espermática (producción intracelular de peróxido de hidrógeno, producción mitocondrial del anión superóxido [O2-], producción total de O2- y peroxidación lipídica), fueron evaluados mediante técnicas de citometría de flujo. El análisis inmunohistoquímico y el western blot (WB) se realizaron en muestras de tejidos de órganos genitales del verraco (testículo, epidídimo y glándulas sexuales accesorias [próstata, glándulas bulbouretrales y vesículas seminales], usando un anticuerpo policlonal primario contra GPX5. Los registros de fertilidad de los verracos fueron evaluados en términos de tasa de parto (número de cerdas que paren respecto al número de cerdas inseminadas), tamaño de camada (número total medio de lechones nacidos por camada) e índice de fertilidad (número de lechones nacidos por cada 100 cerdas inseminadas). Los resultados demostraron que la TAC, la actividad PON-1 y la concentración de la GPX5 y MLT, variaba entre verracos, entre eyaculados dentro del verraco y entre las fracciones del eyaculado. La TAC mostró una relación positiva con parámetros de calidad y funcionalidad espermática de muestras seminales conservadas en estado líquido (15-17 ºC) y congeladas-descongeladas. A su vez, la actividad de PON-1 y la concentración de GPX5 y MLT, estuvieron positivamente relacionadas con parámetros de calidad y/o funcionalidad espermática de muestras seminales conservadas en estado líquido (15-17 ºC). El WB y estudio inmunohistoquímico revelaron la presencia de la GPX5 en todos los órganos genitales. Finalmente, la TAC, la actividad de PON-1 y la concentración de GPX5 mostraron una relación positiva con la fertilidad, pudiendo su determinación en PS ser utilizada como un biomarcador de fertilidad.The PhD Thesis, presented as a compendium of publications and structured by 5 scientific papers, aimed to determine components with antioxidant properties in porcine seminal plasma (SP) and to evaluate its predictive value for sperm quality and functionality and for the fertility of boars used in artificial insemination (AI)-programs. Specifically, the SP-total antioxidant capacity (TAC, paper 1), the enzymes paraoxonase type 1 (PON-1, papers 2 and 3) and glutathione peroxidase 5 (GPX5, paper 4), as well as melatonin (MLT, paper 5) presence/activity in SP were studied. To achieve the objective 821 ejaculates, processed as entire ejaculate or fractions from 440 boars were used and a total of 16,942 sows were inseminated alongside. SP-samples were harvested immediately after ejaculation, through double centrifugation at 1,500 xg for 10 min, and were stored at -80 °C until analyses. The TAC and PON-1 activity were determined using an automated analyzer, assessing 2, 2’-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) decolorization and measuring the hydrolysis of p-nitrophenyl acetate to p-nitrophenol, respectively. The PON-1, GPX5 and MLT concentrations were determined using enzyme-linked immunosorbent assays using a micro-plate reader. Sperm motility was evaluated using a computer-assisted sperm analyzer. Sperm viability and sperm functionality parameters (intracellular production of hydrogen peroxide, mitochondrial production of superoxide anion [O2-], total production of O2- and lipid peroxidation) were evaluated by flow cytometric techniques. Western blot [WB] and immunohistochemistry of samples from testis, epididymis and accessory sex glands (prostate, bulbourethral glands and seminal vesicles) using a primary polyclonal antibody antibody against GPX5. Fertility outcomes of boars were evaluated as farrowing rates (number of farrowing sows respect to the number of inseminated sows), litter size (total number of piglets born per litter) and fertility index (number of piglets born per 100 sows inseminated). The results showed that TAC, PON-1 activity and GPX5 and MLT concentrations, differed among boars, ejaculates within boar and among ejaculate portions within an ejaculate. The TAC showed a positive relationship with sperm quality and functionality parameters of liquid-stored (15-17 ºC) and frozen-thawed semen. Likewise, PON-1 activity or GPX5 and MLT concentrations were positively related to sperm quality and/or functionality parameters of liquid-stored semen samples (15-17 ºC). The WB and immunohistochemical analysis revealed the presence of GPX5 in all genital organs. Finally, TAC, PON-1 activity and GPX5 concentration were positively related with fertility, determining that their measurements in SP, isolated or combined, could be used as fertility biomarkers.