Functional characterization of sirtuins and nicotinamide mononucleotide deamidases

Abstract

In the PhD Thesis entitled “Functional characterization of sirtuins and nicotinamide mononucleotide deamidases”, the objectives were the cloning and biochemical characterization of a new bacterial sirtuin from a Gram-positive extremely halotolerant and alkaliphilic bacterium; the biochemical and mutational study of the NMN deamidase from Agrobacterium tumefaciens, to expand the limited knowledge of NMN deamidases, especially of those with only one domain; the structural and biochemical characterization of an NMN deamidase from an alphaproteobacteria since no NMN deamidases from this group have been previously characterized; and the optimization an easy method for obtaining highly catalytically active, cheap and stable cross-linked enzyme aggregates of E. coli nicotinamide mononucleotide deamidase to obtain NAD+-boosters.

The bacterial sirtuin was cloned into E. coli, overexpressed, and purified to obtain a stable monomeric protein. The enzyme was active towards synthetic acetylated peptides in the presence of NAD+, rendering OAADPr and nicotinamide as products. The enzyme was active over a broad pH range and its inhibition behavior was similar to that described for human sirtuins. The thermal stability of this sirtuin was also studied by a thermal melt assay using Sypro Orange. Finally, an update of the sirtuin classification and phylogeny was carried out to include this new sirtuin, finding two new well-defined groups.

The NMN deamidase from Agrobacterium tumefaciens was cloned into E. coli, overexpressed, and purified to obtain a stable homodimeric protein. The enzyme was able to hydrolyze NMN with a catalytic efficiency similar to the best efficiencies found for NMN deamidases, but with higher thermal and pH stabilities. The mutational analysis carried out supported its classification in the Ser/Lys amidohydrolase family, and expands the limited knowledge of NMN deamidases, especially of those with only one domain (CinA domain).

The NMN deamidase from an alphaproteobacteria was overexpressed into E. coli and purified to obtain a 40 kDa homodimeric protein. The enzyme was able to hydrolyze NMN with a high catalytic efficiency, similar that described for the most active NMN deamidases, being the first report of an NMN deamidase from an alphaproteobacteria. In addition, this thesis described for the first time three new protein structures. Two from the cloned alphaproteobacteria NMN deamidase, one in the in apo form and the other with NaMN bound, and the third from E. coli NMN deamidase in the apo form. These structures shed light into the Ser/Lys amidohydrolase catalytic mechanism shown by NMN deamidases having a serine as the amino acid that places in position the amide group of the nicotinamide moiety of NMN.

Finally, a new enzymatic process using recombinant NMN deamidase immobilized in the form of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) was developed to obtain nicotinic acid mononucleotide (NaMN). The immobilization process was optimized using different precipitants and dispersing technologies. CLEAs with full deamidase activity were recovered in short period of time by co-aggregation with bovine serum albumin combined with a reciprocating dispersing methodology. These CLEAs showed high activity, storage and operational stability for the production of NaMN, suggesting the first time that CLEA technology could be used to obtain highly valuable NAD+-boosters. In addition, this is also the first report on a Ser/Lys catalytic dyad enzyme immobilized as CLEAs. En la Tesis Doctoral titulada “Caracterización funcional de sirtuinas y nicotinamida mononucleótido deamidasas”, los objetivos fueron la clonación y caracterización bioquímica de una nueva sirtuina bacteriana procedente de una bacteria Gram positiva, extremadamente halotolerante y alcalófila; el estudio bioquímico y mutacional de una NMN deamidasa de Agrobacterium tumefaciens, para ampliar el conocimiento limitado sobre estas enzimas, especialmente de aquellas formadas por un único dominio; la caracterización bioquímica y estructural de una NMN deamidasa procedente de una α-proteobacteria puesto que ninguna NMN deamidasa de este grupo de bacterias ha sido previamente caracterizada; y la optimización de un método sencillo para la obtención de agregados reticulados de enzima muy activos, baratos y estables de la NMN deamidasa de E. coli para obtener potenciadores de NAD+. La sirtuina bacteriana fue clonada, sobreexpresada en E. coli, y purificada hasta obtener una proteína monomérica estable. La enzima fue activa sobre péptidos sintéticos acetilados en presencia de NAD+, generando OAADPr y nicotinamida como productos. La enzima fue activa en un amplio rango de pH y fue inhibida de forma similar a la descrita para sirtuinas humanas. La estabilidad térmica de esta sirtuina se estudió también mediante el ensayo de temperatura de fusión empleando la sonda Sypro Orange. Finalmente, se llevó a cabo una actualización de la clasificación y filogenia de esta familia de enzimas para incluir esta nueva sirtuina, encontrando dos nuevos grupos bien definidos. La NMN deamidasa de Agrobacterium tumefaciens fue clonada, sobreexpresada en E. coli, y purificada hasta obtener una proteína homodimérica estable. La enzima fue capaz de hidrolizar NMN con una eficiencia catalítica similar a las mejores eficiencias catalíticas encontradas en la bibliografía para otras NMN deamidasas, pero con una mayor estabilidad a la temperatura y al pH. El análisis mutacional llevado a cabo apoyó su clasificación dentro de la familia de las Ser/Lys amidohidrolasas, y amplió el limitado conocimiento sobre NMN deamidasas, especialmente de aquellas formadas por un único dominio (dominio CinA). La NMN deamidasa de una α-proteobacteria fue sobreexpresada en E. coli y purificada hasta obtener una proteína homodimérica de 40 kDa. La enzima fue capaz de hidrolizar NMN con una alta eficiencia catalítica, similar a la descrita para la mayoría de NMN deamidasas descritas, siendo la primera vez que se estudia una NMN deamidasa de una α-proteobacteria. Además, esta tesis describió por primera vez tres nuevas estructuras de proteína. Dos de la NMN deamidasa clonada de la α-proteobacteria, una en la forma apo y otra con NaMN unido, y una tercera correspondiente a la NMN deamidasa de E. coli en la forma apo. Estas estructuras aclararon el mecanismo catalítico de las Ser/Lys amidohidrolasas mostrado por las NMN deamidasas que usan un residuo de serina para posicionar el grupo amida de la nicotinamida del NMN. Finalmente, un nuevo proceso enzimático usando NMN deamidasa inmovilizada en la forma de agregados reticulados de enzima (CLEAs) se desarrolló para obtener ácido nicotínico mononucleótido (NaMN). El proceso de inmovilización fue optimizando usando diferentes precipitantes y técnicas de dispersión. Las CLEAs con plena actividad NMN deamidasa fueron obtenidas en un corto periodo de tiempo mediante la coagregación con albúmina sérica bovina y una nueva metodología de dispersión. Estas CLEAs mostraron una gran actividad, estabilidad operacional y de almacenaje para la producción de NaMN, sugiriendo por vez primera que la tecnología de CLEAs puede ser empleada para obtener potenciadores de NAD+ de alto valor económico. Además, esta fue la primera vez que se inmovilizó una enzima con Ser/Lys como diada catalítica en forma de CLEAs.