Non-canonical function of the telomerase in metastasis : new strategies for tumor aggressiveness prediction

Abstract

En el presente trabajo se proponen los siguientes objetivos concretos: 1. Caracterización del mecanismo por el que la sobre-expresión de TERT influye en el aumento de la invasión y metástasis de células tumorales.

2. Validación del modelo de pez cebra para el estudio de la invasividad de células humanas mediante experimentos de xenotrasplante. Material y métodos Se estudió el papel extracurricular de la telomerasa en distintas líneas cancerígenas utilizando el pez cebra como modelo animal de xenotrasplante, viendo el porcentaje de invasión en larvas de 3 días post inyección. Los peces se microinyectaban con celulas teñidas con CM-Dil , un colorante vital y a los tres días se veía el resultado. Se estudió mediadnte PCR cuantitativa la expresion de distintos miRNAs que están regulados por la telomerasa, en concreto el miR 500, que esta sobreexpresado. Para entender mejor si esta regulacion del miR 500 esta correlacionada con la invasión celular en pez cebra, se realizaron transfecciones, sobreexpresando e inhibiendo miR 500 y viendo que hay una correlación entre miR 500 y la invasión en el modelo de pez cebra. Se estudió el papel de la hTERT como regulador del cluster donde está el miR 500 , para ello se realizo una imnunoprecipitación de la cromatina(CHIP) y se amplificaron unas regiones aguas arriba del miR 500 mediante PCR cuantitativa. Para confirmar estos datos de la unión de hTERT aguas arriba del miR 500 se desarrolló un experimento de luciferasa. Se clonó la región aguas arriba del miR 500 y vimos si la relación firefly/renila aumenta al tener más telomerasa o al contrario, descendía al inhibir la telomerasa. Para descartar que el efecto era independiente de la telomerasa, se realizo el experimento de luciferasa con un dominate negativo de hTERT que no tiene actividad telomerasa, y se vio que actuaba aumentando la expresión de luciferasa. Confirmando nuestras hipótesis se realizaron suceivas PCRs cuantitativas para ver si hTERT regulaba no solo el miR 500 sino también el cluster. Estos datos en celulas se reflejaron en pacientes de mama analizando la expresión de miR 500 en pacientes con cáncer de mama y viendo las diferencias entre sano y tumoral.

Conclusiones Los resultados de este trabajo conducen a las siguientes conclusiones: 1. La sobre-expresión de hTERT en células de osteosarcoma (hTERT-SAOS 2), que mantienen su longitud telomerica por medio del mecanismo alternativo ALT, incrementa su agresividad en los experimentos de xenotransplante en pez cebra con respecto al control (pBABE-SAOS 2).

2. La sobre-expresión de hTERT afecta a la expresión de un grupo de microRNAS, entre ellos miR500a.

3. miR-500a desempenia una funcion fundamental en la capacidad invasiva de las celulas de osteosarcoma, ya que su sobre-expresión o su inhibición aumenta la invasión o la disminuye, respectivamente, en experimentos de xenotrasplante en pez cebra.

4. hTERT regula la expresión de mir500a a través de la unión directa a una región aguas arriba de dicho microRNA. Esa región regula la expresion de todo el grupo de genes (hsa-miR500a, hsa-miR-362, hsa-mir-500b y hsa-miR-502) excepto a hsa-miR532, que se encuentra aguas arriba de la región. 5. La región reguladora de 2 Kb aguas arriba del grupo de microRNAs a la que se une hTERT, tiene actividad promotora.

6. Se han identificado algunas de las dianas de mRNA por las que miR500a podría actuar en cáncer. Estas dianas están implicadas en rutas moleculares tan importantes y decisivas en cáncer como Hedgehog y Wnt / β- Catenina.

7. mir500a constituye un marcador de agresividad en cáncer de mama y puede ser utilizado para pronóstico y como diana terapéutica.

8. El pez cebra es un modelo excepcional para predecir la capacidad invasiva de células tumorales.

Objetives

The specific objectives of the present work are: 1. Characterization of the mechanism by which TERT overexpression influences the increased invasion capacity and metastasis of tumor cells.

2. Validation of the zebrafish model to study the invasion capacity of human tumor cells by xenograft experiments. Material and methods: The extracurricular role of telomerase was studied in different cancerous lines using the zebrafish model as an animal for xenotransplantation, measuring the invasion of percentage 3-day post-injection of the larvae. The fish were microinjected with tumor cells that previously was stained with CM-Dil, a vital dye that blind to the cell membrane and three days later We can obserbe the result in a Fluorescence stereomicroscope with a cherry filter. The miRNAs expression are regulated for the human trascriptase reverse of the telomerase and It was measure by RT-PCR specifically the miR 500 was statistically significant. To better understand if the regulatory mechanism of miR 500 is correlated with cellular invasion in zebrafish, Transfections were performed, overexpressing and inhibiting miR 500 and seeing that there is a correlation between miR 500 and the invasion in the zebrafish model. We studied the role of hTERT as regulator of the cluster where the miR 500 is, Chromatin immunoprecipitation (CHIP) was performed and regions upstream of miR 500 were amplified by quantitative PCR. We used diferent primer to find the hypothetical region in which blind human telomerase. A luciferase experiment was performed to confirm the binding upstream of the miR 500 of hTERT. The miR 500 upstream region was cloned and we saw if the firefly / renilla ratio increases by having more telomerase or conversely, it decreased by inhibiting telomerase. To rule out that the effect was independent of telomerase, the luciferase experiment was performed with a dominant hTERT negative that don´t have telomerase activity because are mutated in the catalytic region. And the data was shown to act by increasing luciferase expression. Confirming our hypotheses, we performed succesive RT- PCRs to show if hTERT regulated miR 500 and the rest of the miRNA cluster . These data “in vitro”with cancer cells lines were reflected in breast patients by analyzing the expression of miR 500 in patients with breast cancer that in pathological anatomy had excised the breast and the result showed differences between healthy patients and tumor breast cancer patients.

5. Conclusions The results obtained in this work lead to the following conclusions: 1. hTERT overexpression in Sarcoma osteogenic cells (hTERT-SAOS 2), which maintain their telomere length through the alternative mechanism ALT, increases their aggressiveness in zebrafish xenograft experiments compared to control (pBABE-SAOS 2).

2. hTERT overexpression affects the expression of a microRNAs cluster that includes miR-500a. 3. miR-500a plays an essential role in the invasion capacity of osteosarcoma cells, since its overexpression or inhibition increases or decreases the invasion, respectively, in zebrafish xenograft experiments.

4. miR-500a expression is regulated by hTERT through the direct binding to an upstream region of miR-500a. This region regulates the expression of all the cluster genes (hsa-miR500a, hsa-miR-362, hsa-mir-500b and hsa-miR-502) except for hsa-miR532, which is upstream of this region.

5. A 2 Kb regulatory region upstream the microRNA-500a has promoter activity and this promoter is regulated by human TERT.

6. We have identified some mRNA targets through which miR-500a could act in cancer. These targets are involved in important cancer pathways, such as Hedgehog and Wnt / β- Catenina pathways.

7. miR-500a constitutes an aggressiveness marker in breast cancer and can be used for prognosis and as a therapeutic target.

8. The zebrafish is an exceptional model for predicting the degree of invasiveness of tumor cells.