Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/55353

Title: Estudio metabolómico y genómico de cultivos celulares de zanahoria
Issue Date: 9-Jan-2018
Date of creation: 9-Jan-2018
Related subjects: CDU::5 - Ciencias puras y naturales::57 - Biología::577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
CDU::6 - Ciencias aplicadas::63 - Agricultura. Silvicultura. Zootecnia. Caza. Pesca::635 - Plantas de jardín. Jardinería
Keywords: Hortalizas
Agricultura biológica
Abstract: El objetivo principal de este trabajo de investigación fue caracterizar los metabolitos secundarios producidos en dos líneas celulares de zanahoria. Para ello, uno de los objetivos concretos fue la caracterización de la producción de compuestos de naturaleza isoprenoide y compuestos fenólicos en suspensiones celulares de una línea celular verde de Dacus carota en condiciones control y en condiciones de elicitación con ciclodextrinas, jasmonato de metilo, hexenol y β-glucano separadamente o en combinación. De la misma manera, se caracterizó la producción de isoprenoides y compuestos fenólicos en suspensiones celulares de una línea celular naranja de D. carota en condiciones control y en condiciones de elicitación con ciclodextrinas y jasmonato de metilo. Asimismo, se estudio la producción de fitosteroles y carotenoides y la expresión de genes implicados en su ruta biosintética en suspensiones celulares de una línea celular naranja de D. carota en presencia de inhibidores de la ruta de biosíntesis de carotenoides y fitosteroles. Los resultados derivados de este estudio muestran que la línea celular de zanahoria verde biosintetizó de manera constitutiva los siguientes isoprenoides: carotenoides, α-tocoferol, clorofilas a y b y fitosteroles. El principal isoprenoide encontrado en la línea verde fue la luteína, una xantofila amarilla. La caracterización de la línea celular de zanahoria verde mostró que los fitoesteroles y compuestos fenólicos se acumularon principalmente en el medio extracelular (15100 μg/L y 477,5 μg/L, respectivamente) en presencia de ciclodextrinas. A diferencia de los compuestos mencionados anteriormente, el β-caroteno (1138,1 μg/L), la luteína (25949,5 μg/L), el α-tocoferol (8063,8 μg/L) y la clorofila a (1625,1 μg/L) y b (9958,3 μg/L) se acumularon principalmente dentro de las células. Por lo tanto, los ciclodextrinas fueron capaces de inducir la ruta biosintética del mevalonato, aumentando la biosíntesis de fitoesteroles y compuestos fenólicos, y acumulándolos fuera de las células. Sin embargo, en ausencia de ciclodextrinas, las células de la zanahoria acumularon principalmente carotenoides a través de la ruta biosintética del 4-fosfato de metileritritol. Por lo tanto, el uso de ciclodextrinas permitiría la acumulación extracelular de fitoesteroles y compuestos fenólicos incrementando el flujo de carbono hacia la ruta citosólica del mevalonato y hacia la ruta de biosíntesis fenilpropanoide. Además, β-glucano fue capaz de inducir la acumulación intracelular de α-tocoferol en la línea de células de zanahoria verde. Por otro lado, la línea celular de zanahoria naranja biosintetizó de manera constitutiva carotenoides y fitoesteroles. Los principales isoprenoides acumulados en esta línea celular fueron β-caroteno y luteína. El análisis de esta línea naranja en condiciones de elicitación (50 mM ciclodextrinas) mostró que los fitoesteroles se acumulaban principalmente en el medio extracelular. Sin embargo, el β-caroteno y la luteína se acumularon esencialmente dentro de las células. El tratamiento combinado de ciclodextrinas y jasmonato de metilo mejoró la acumulación extracelular de compuestos fenólicos. Por lo tanto, la línea celular de zanahoria naranja bajo condición de elicitación proporciona un sistema biotecnológico eficiente para producir compuestos bioactivos. La adición de Terbinafina y Diflufenican que inhiben las rutas biosintéticas de fitoesteroles y carotenoides respectivamente, provocó una alta acumulación de escualeno y fitoeno. Estos compuestos bioactivos no suelen acumularse y, debido a esto, la línea celular de zanahoria naranja tratada con estos inhibidores es una fuente alternativa para producirlos. Los niveles de expresión más altos del gen escualeno sintasa se encontraron después de 24h de tratamiento con el inhibidor terbinafina. Esto puede explicar la alta acumulación intracelular de escualeno sin efecto negativo sobre los niveles de fitosteroles. Además, las ciclodextrinas no aumentaron los niveles de expresión de escualeno sintasa. Este hecho puso de manifiesto que los ciclodextrinas no funcionan como moléculas inductoras en la biosíntesis de los fitoesteroles, sino que son capaces de extraerlos de las membranas celulares. Por último, los niveles de expresión del gen fitoeno desaturasa 1 sugirieron que la acumulación del contenido total de carotenoides podría estar vinculada a la expresión de este gen. Sin embargo, el tratamiento con diflufenican disminuyó los niveles de expresión de fitoeno sintasa 1 y fitoeno desaturasa, lo que sugiere que la alta acumulación de fitoeno no se correlacionó con un alto nivel de expresión de estos genes. The main objective was to characterize secondary metabolites produced in two carrot cell lines. Thus, one of the specific objectives was to characterize the production of isoprenoid and phenolic compounds in cell suspensions of a Daucus carota green cell line under control conditions and under elicitation conditions with cyclodextrins, methyl jasmonate, Hexenol and β-glucan separately or in combination. Moreover, the production of isoprenoids and phenolic compounds was characterized in cell suspensions of orange D. carota cell line under control conditions and under conditions of elicitation with cyclodextrins and methyl jasmonate. It was also studied the production of phytosterols and carotenoids and the expression of genes involved in their biosynthetic pathway in cell suspensions of orange D. carota cell line in the presence of inhibitors of the biosynthesis pathway of carotenoids and phytosterols. The results derived from this study refer to the green carrot cell line constitutively biosynthesized the following isoprenoids: carotenoids, α-tocopherol, chlorophyll a and b, and phytosterols. The main isoprenoid found in this green carrot line was lutein, a yellow xanthophyll. The characterization of the green carrot cell line showed that phytosterols and phenolic compounds wew mainly accumulated in the extracellular medium (15100 μg/L and 477.5 μg/L, respectively) in the presence of cyclodextrins. Unlike the aforementioned compounds, β-carotene (1138.1 μg/L), lutein (25949.5 μg/L), α-tocopherol (8063.8 μg/L) and chlorophyll 1625.1 μg/L) and b (9958.3 μg / L) were mainly accumulated within the cells. Therefore, cyclodextrins were able to induce the biosynthetic pathway of mevalonate, increasing the biosynthesis of phytosterols and phenolic compounds, and accumulating them outside the cells. However, in the absence of cyclodextrins, carrot cells mainly accumulated carotenoids through the methylerythritol 4-phosphate biosynthetic pathway. Therefore, the use of cyclodextrins would allow the extracellular accumulation of phytosterols and phenolic compounds by increasing the flow of carbon towards the mevalonate cytosolic pathway and towards the phenylpropanoid pathway. In addition, β-glucan was able to induce the intracellular accumulation of α-tocopherol in the green carrot cell line. On the other hand, the orange carrot cell line constitutively biosynthesized carotenoids and phytosterols. The major isoprenoids accumulated in this cell line were β-carotene and lutein. Analysis of this orange line under elicitation conditions (50 mM cyclodextrins) showed that phytosterols accumulated mainly in the extracellular medium. However, β-carotene and lutein were essentially accumulated within the cells. Combined treatment of cyclodextrins and methyl jasmonate improved the extracellular accumulation of phenolic compounds. Therefore, the orange carrot cell line under elicitation condition provides an efficient biotechnological system to produce bioactive compounds. The addition of Terbinafine and diflufenican, which inhibited the biosynthetic pathways of phytosterols and carotenoids respectively, caused a high accumulation of squalene and phytoene. These bioactive compounds are not usually accumulated and, because of this, the orange carrot cell line treated with these inhibitors is an alternative source to produce them. The highest expression levels of the square gene were found after 24h of treatment with the inhibitor terbinafine. This fact may explain the high intracellular accumulation of squalene with no negative effect on phytosterol levels. In addition, the cyclodextrins did not increase the expression levels of squalene synthase. This fact revealed that cyclodextrins do not function as induction molecules in the biosynthesis of phytosterols, but are capable of extracting them from cell membranes. Finally, gene expression levels of squalene synthase suggest that the accumulation of total carotene content could be linked to the expression of this gene. However, treatment with diflufenican decreased expression levels of phytoene synthase 1 and phytoene desaturase, suggesting that high phytoene accumulation did not correlate with a high level of expression of these genes.
Primary author: Miras Moreno, María Begoña
Director: Pedreño García, Mª Ángeles
Almagro Romero, Lorena
Sabater Jara, Ana Belén
Faculty / Departments / Services: Facultad de Biología
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/55353
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 184
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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