Biomarcadores para la estimación del intervalo postmortem y la identificación de patologías en restos óseos humanos

Abstract

La estimación del intervalo postmortem es un objetivo importante en la medicina forense y sigue siendo una de las tareas más difíciles del investigador forense. En realidad, existen pocos métodos precisos para determinar el tiempo transcurrido desde la muerte de los restos humanos esqueletizados debido al gran número de factores intrínsecos que pueden alterar el curso normal del cambio postmortem, como la edad, el sexo, la constitución y los estados fisiológicos y patológicos previos de la enfermedad del sujeto y factores externos. El primer objetivo de esta investigación es evaluar la utilidad de diversos parámetros bioquímicos como las bases nitrogenadas (adenina, guanina, purinas, citosina, timina, pirimidinas, hipoxantina, xantina, cociente de purinas/pirimidinas y cociente de pirimidinas/purinas), ADN y péptidos de colágeno tipo I en el hueso cortical para la establecimiento del IPM en un total de 80 huesos largos de 80 cadáveres (50 hombres, 27 mujeres y 3 indeterminados) con una edad media de 68.31 años (DE=18.021, rango=20-97). Los huesos fueron retirados de los nichos de cemento de un cementerio de Murcia (sudeste de España), donde habían permanecido entre 5 y 47 años (tiempo medio 23.83 años, DE=10.85). El procedimiento seguido para la determinación de bases nitrogenadas, ácidos nucleicos y péptidos de colágeno tipo I fue la realización de HPLC-UV, fluorimetría y HPLC-MS/MS, respectivamente. Nuestros resultados confirman que el hueso es una matriz adecuada para la extracción, identificación y cuantificación, mediante los protocolos y técnicas empleadas, de ADN, bases nitrogenadas y péptidos de colágeno tipo I en un IPM entre 5 y 47 años. Además, nuestra investigación muestra como las concentraciones de adenina respecto a guanina, de timina respecto a citosina y de purinas respecto a pirimidinas son significativamente superiores en este IPM, así como el establecimiento de correlaciones significativas negativas entre las bases nitrogenadas y los péptidos de colágeno tipo I analizados y el IPM, que siguen un modelo de decrecimiento exponencial y logarítmico, respectivamente. En un IPM inferior a 20 años las concentraciones de varias bases nitrogenadas y de los péptidos de colágeno tipo I son significativamente superiores frente a un IPM superior o igual a 20 años, además, existe una correlación significativa negativa entre las biomoléculas y estos intervalos, con una tendencia Resumen exponencial. El uso de forma conjunta de todos los biomarcadores cuantificados en esta investigación permite la correcta clasificación de muestras en grupos de IPM inferior a 20 años y superior o igual a 20 años del 86.7%. Por otro lado, otro de los problemas que presenta la medicina forense es la identificación de los sujetos, en este caso, la patología forense a menudo utiliza la osteobiografía, que implica perfiles biológicos basados en la determinación de la edad, sexo, constitución, estados patológicos y otras anomalías (paleopatología) de los sujetos con fines de identificación. El segundo objetivo de esta investigación es analizar las proteínas en restos óseos para buscar biomarcadores patológicos que estén estrechamente relacionados con varias enfermedades. Se utilizaron 45 huesos largos de 45 cadáveres diferentes (29 varones, 16 mujeres) con una edad media de 66.31 años (DE=19.48, rango=20-97). Los huesos se encontraban en nichos de cemento de un cementerio murciano (sudeste de España), donde habían permanecido entre 18 y 45 años (tiempo medio 25.84 años, DE=8.91). Después de una extracción específica utilizando tampón Tris-Urea, se identificaron usando HPLC-MS/MS. Nuestros resultados muestran que las proteínas resultantes de enfermedades tumorales y patógenos bacterianos y virales pueden ser detectados e identificados en los restos óseos, convirtiéndolos en biomarcadores patológicos útiles para la construcción de perfiles biológicos.

Estimation of postmortem interval is an important goal in forensic medicine and continues to be one of the more difficult tasks of the forensic investigator. Actually, few accurate methods exist to determine the time since death of skeletonized human remains due to the great number of intrinsic factors that may alter the normal course of postmortem change, such as the age, sex, constitution and previous physiological and pathological states of the subject, and external factors. The purpose of this research, is to assess the utility of various biochemical parameters such as the nitrogenous bases (adenine, guanine, purines, cytosine, thymine, pyrimidines, hypoxanthine, xanthine, purine/pyrimidine ratio and pyrimidine/purine ratio), DNA and peptides of collagen type I in cortical bone for the establishment of data in a total of 80 long bones of 80 corpses (50 males, 30 females) with a mean age of 68.31 years (S.D.=18.021, range=20-97) were used. The bones were removed from the cement niches of a cemetery in Murcia (south-eastern Spain), where they had lain for between 5 and 47 years (mean time 23.83 years, S.D.=10.85). The procedure followed for the determination of nitrogenous bases, nucleic acids and peptides of Collagen Type I was the realization of HPLC-UV, fluorometry and HPLC-MS/MS respectively. Our results confirm that bone is a suitable matrix for the extraction, identification and quantification, through protocols and techniques used, of DNA, nitrogenous bases and peptides of collagen type I in a PMI between 5 and 47 years. In addition, our research shows how adenine concentrations from guanine, thymine to cytosine and purines to pyrimidines are superior higher in this PMI, as well as the establishment of significant inverse relationships between the nitrogenous bases and the peptides of collagen type I analyzed and the PMI, which follow an exponential and logarithmic decrease model, respectively. In a PMI up to 20 years the concentrations of several nitrogenous bases and the peptides of collagen type I are significantly superior to a PMI superior or equal to 20 years, furthermore, there is a significant inverse relationship between the biomolecules and these intervals, with an exponential trend. The use of the combined form of all biomarkers quantified in this research allows the correct classification of the samples in the PMI groups less than 20 years and superior than or equal to 20 years of 86.7%.In other hand, other of the problems presents in forensic medicine is the identification of the subjects, in this case forensic anthropology often uses osteobiography, which involves biological profiles based on a determination of the age, sex, constitution, pathological states and other anomalies (paleopathology) of subjects for identification purposes. The second purpose of this investigation is analyzing proteins in bone remains to search for pathological biomarkers which are closely related to several diseases. A total of 45 long bones from 45 different cadavers (29 males, 16 females) with a mean age of 66.31 years (S.D.=19.48, range 20–97) were used. The bones were in cement niches of a cemetery in Murcia (south- eastern Spain), where they had lain for between 18 and 45 years (mean time 25.84 years, S.D.=8.91). After a specific extraction using Tris-Urea buffer, were identified using HPLC-MS/MS. Our results show that proteins resulting from tumoral diseases and bacterial and viral pathogens can be detected and identified in the skeletal remains, making them useful pathological biomarkers for constructing biological profiles.