Participación de las proteínas Redox Tiorredoxina (Trxo1) y Peroxirredoxinas (PrxIIF, 2-CysPrx) de guisante y arabidopsis, en ciclo celular, estrés salino y glutationalización

Abstract

En esta Tesis doctoral hemos llevado a cabo el estudio funcional de la tiorredoxina de guisante PsTrxo1 de localización mitocondrial y nuclear y de la tiorredoxina de Arabidopsis AtTrxo1 mitocondrial. El estudio de la función de PsTrxo1 en el núcleo mediante ensayos in vitro dot blot y de complementación por bifluorescencia, ha revelado su interacción en el núcleo con la proteína PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular), previamente descrita como posible proteína diana de esta Trxo1. Además, hemos demostrado la regulación redox de PCNA por el sistema NADPH/tiorredoxin reductasa/PsTrxo1 a través de la reducción de sus cisteínas. Paralelamente, hemos observado que la sobre-expresión de PsTrxo1 en células de tabaco BY-2 afecta a la proliferación celular, índice mitótico y contenido proteico de PCNA, así como a los contenidos y localización subcelular del antioxidante glutatión, fundamentalmente en las fases avanzadas del cultivo. Todo ello sugiere que PsTrxo1 está implicada en la progresión del ciclo celular de TBY-2, posiblemente a través de su relación con PCNA y glutatión. La caracterización fisiológica y bioquímica de dos líneas mutantes KO AtTrxo1 en condiciones control y de estrés salino ha revelado una falta de fenotipo evidente acompañada de algunos cambios en la respuesta del sistema antioxidante, parámetros oxidativos y densidad estomática. Esto sugiere que la falta de Trxo1 puede estar compensada en los mutantes por diferentes mecanismos incluyendo el sistema antioxidante, que estarían colaborando para mantener la integridad de la planta. Un estudio transcriptómico por RNaseq en condiciones de salinidad, que incluye además a una línea sobre-expresante AtTrxo1, ha revelado una alteración en genes implicados en distintos procesos metabólicos de diferentes compartimentos celulares, algunos de ellos relacionados con proteínas descritas como diana de tiorredoxinas. Finalmente se ha realizado un estudio post-traduccional de glutationalización de dos peroxirredoxinas, PsPrx IIF mitocondrial y Ps2-Cys Prx cloroplastídica, identificando las cisteínas modificadas por espectrometría de masas, el efecto sobre su estructura oligomérica y la dependencia del ratio GSH/GSSG como agentes glutationalizantes. Además el descenso observado de la actividad peroxidasa de ambas proteínas revela el potencial de esta modificación posttraduccional para regular la señalización celular mediada por H2O2, sustrato de estas peroxirredoxinas. Abstract This Doctoral Thesis presents a functional study of a pea thioredoxin PsTrxo1, with a double location in pea mitochondria and nucleus, and a mitochondrial Arabidopsis AtTrxo1. The study of the PsTrxo1 function in the nucleus using in vitro dot-blot and a bifluorescence complementation assay has revealed its interaction in this organelle with the protein proliferating cellular nuclear antigen (PCNA), previously identified by affinity techniques as a possible target of this Trxo1. We have also demonstrated the redox regulation of PCNA by the NADPH/NTR/PsTrxo1 system through the reduction of its cysteine residues. In parallel, we have shown that the over-expression of PsTrxo1 in tobacco BY-2 cells increases cellular proliferation, the mitotic index and PCNA protein content, affecting the level and subcellular location of the antioxidant glutathione, mainly in the advanced phases of the cell culture. All these data suggest that Trxo1 is involved in the cell cycle progression of the TBY-2 culture, possibly through its relation with PCNA and glutathione. The biochemical and physiological characterization of two Arabidopsis KO AtTrxo1 mutant lines in control and saline stress conditions has revealed a lack of an evident phenotype accompanied by changes in the response of the antioxidant system, oxidative parameters and stomatal density. This suggests that the lack of Trxo1 might be compensated in the mutants by different mechanisms, including the antioxidant system, which may collaborate to support the integrity of the plant. A transcriptomic study by RNAseq under salinity, also including an overexpressing AtTrxo1 line, has revealed an alteration in genes involved in several metabolic processes of different subcellular compartments, some of them related to proteins described as thioredoxin targets. Finally, we carry out a posttranslational glutathionylation study of two peroxiredoxins: mitochondrial PsPrx IIF and chloroplastidic 2-Cys Prx, identifying the modified cysteine residues by mass spectrometry, the effect on their oligomeric structure and the dependence of the GSH/GSSG ratio as glutathionylating agents. Also, the decrease observed in the peroxidase activity of both proteins revealed the potential of this posttranslational modification to regulate cellular signaling through H2O2 controlled by both peroxiredoxins.