Optimization of the agrobacterium-mediated transformation process of grapevine cell cultures and evaluation of its effect on secondary metabolism= Optimización del proceso de transformación mediada por agrobacterium de cultivos celulares de vid y evaluación de su efecto sobre el metabolismo secundario

Abstract

Objetivos: El objetivo de este trabajo fue mejorar la producción de trans-resveratrol utilizando dos estrategias diferentes: el establecimiento de líneas celulares transgénicas que sobre-expresan el gen de la estilbeno sintasa (sts) implicado en la biosíntesis de trans-resveratrol y la utilización de la elicitación con ciclodextrinas y/o metil jasmonato en las líneas transgénicas producidas. Para ello es necesario desarrollar un protocolo de transformación eficiente y estable de suspensiones celulares de Monastrell utilizando la metodología de transformación mediada por Agrobacterium y asistida por ultrasonidos, y optimizar todos los factores que afectan la eficiencia de transformación. Este protocolo de transformación eficiente y estable se utilizará para transferir el gen sts a células de Monastrell para obtener diferentes líneas celulares transgénicas que serán elicitadas con ciclodextrinas (CD) y/o metil jasmonato (MJ). Estas líneas celulares transgénicas serán evaluadas para determinar si son capaces de producir niveles de trans-resveratrol más elevados que las líneas celulares no transgénicas. Metodología: Las suspensiones celulares (SCC) de V. vinifera cv. Monastrell se infectaron con la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 portando el plásmido pMOG800-nptII-eyfp/IV2 que se había cultivado en medio líquido de levaduras con extracto de manitol (YM). Se estudiaron diferentes factores que podrían afectar el proceso de transformación tal como diferentes tiempos de aplicación de ultrasonidos durante la infección con Agrobacterium (SAAT), la fase óptima de crecimiento de las células en el momento de la infección, la densidad celular de siembra óptima, la selección con antibióticos apropiada, etc. Para comprobar la transformación de los SCC se extrajo el ADN genómico y se realizaron PCRs con diferentes cebadores diseñados para amplificar específicamente los transgenes nptII y eyfp/IV2. Además, se llevaron a cabo hibridaciones Southern para comprobar la integración del transgen y se estudió la viabilidad celular de varias líneas transgénicas en presencia de diferentes concentraciones de paromomicina. Una vez que se dispuso de un protocolo optimizado, se utilizó la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404, portando el plásmido pMOG800-nptII-sts-eyfp/IV2, para introducir el gen de la estilbeno sintasa en SCCs. Para evaluar la transformación de los SCC con el sts se extrajo el ADN genómico y se realizaron PCRs con cebadores para amplificar los transgenes marcadoresasi como el 35s-sts (cebadores específicos para el sts transgénico). Para estudiar el efecto de este gen se cuantificó la producción de trans-resveratrol y se estudió la expresión del sts endógeno y transgénico tras elicitar con CD y/o MJ. Para hacer esto el ARN total fue aislado, el cDNA sintetizado y amplificado con cebadores específicos para el transgen sts mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Results: Se ha desarrollado un protocolo eficiente de transformación de SCC no diferenciados de Monastrell mediante la utilización de SAAT. La densidad celular de siembra, el agente selectivo y el estado de desarrollo del SCC fueron factores cruciales para determinar la eficiencia de transformación. Los mejores resultados se obtuvieron cuando las células se infectaron en la fase exponencial y se cultivaron después del co-cultivo con elevada densidad (500 mg/placa) en medio selectivo con paromomicina. Este protocolo se utilizó para introducir el gen sts en SCC de Monastrell consiguiéndose más de 50 líneas SCC transgénicas. Estas células fueron elicitadas con ciclodextrinas y/o metil jasmonato para optimizar la producción de trans-resveratrol. Una línea (F2) produjo los niveles más elevados de trans-resveratrol en comparación con otras líneas transgénicas y con las líneas celulares silvestres. En la SCC transgénica F2 aunque el perfil de expresión del gen sts (endógeno + transgénico) fue similar al del gen endógeno en la línea silvestre, los niveles de expresión fueron mucho más elevados en la línea transgénica. De hecho, los niveles de expresión de sts fueron más elevados tras 6 h de cultivo en todos los tratamientos evaluados y decrecieron rápidamente después. Sin embargo, la expresión del gen sts se incrementó después de 72 h de cultivo en condiciones de elicitación con CD y MJ en combinación y se mantuvo hasta el final del experimento. Conclusions: Por primera vez se ha desarrollado un protocol de transformación para cultivos celulares no diferenciados de Vitis vinífera que se basa en la utilización de la transformación mediada por Agrobacterium y asistida por ultrasonidos (SAAT) y en la optimización de todos los factores que afectan la eficiencia de transformación (específicamente la fase de crecimiento celular, la densidad de siembre y la selección con antibióticos). El sistema de transformación desarrollado en este estudio ha permitido la introducción de genes implicados en el metabolismo secundario en las células de vid. Mediante elicitación con CD y MJ como segunda estrategia para mejorar la producción de trans-resveratrol hemos obtenido una línea celular que produjo elevados niveles de trans-resveratrol. Por lo tanto la elicitación de suspensiones celulares transgénicas de Vitis vinífera cv Monastrell podría utilizarse para una producción sostenible de elevados niveles de trans-resveratrol. Summary

Objectives: The aim of this work was to improve the production of trans-resveratrol using two different strategies: the establishment of transgenic cell lines which overexpressed the stilbene synthase, sts gene, involved in trans-resveratrol biosynthesis, and using elicitation with cyclodextrins and/or methyl jasmonate in these transgenic cell lines. For this, it is needed to develop a stable and efficient transformation protocol of Monastrell suspension cultured cells using Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation, and optimizing all the factors affecting transformation efficiency. This stable and efficient transformation protocol will be used to transfer sts gene to Monastrell cells, in order to obtain different transgenic cell lines, which will be elicited with cyclodextrins (CD) and/or (MJ). These transgenic cell lines will be screened in order to determine if they are able to produce higher levels of trans-resveratrol in comparison to non-transgenic cell lines. Material and Methods: Suspension-cultured cells (SCC) of V. vinifera L. cv. Monastrell were infected with Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 harboring the plasmid pMOG800-nptII-eyfp/IV2 grown in yeast extract-mannitol (YM) liquid medium. Different factors that may be affecting the transformation process were studied such as different times of Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated infection, optimum growth phase of cells to be infected, optimum plating density, antibiotic selection, etc. To check transformation of SCC genomic DNA was extracted and specific primers to amplify nptII and eyfp/IV2 were used to run PCRs. Also, Southern blot hybridizations were carried out to check the integration of the transgene. Additionally, cell viability in the presence of different paromomycin concentrations was studied in different transgenic lines. Once an optimum protocol was developed, Agrobacterium tumefaciens strain LBA 4404 harboring the plasmid pMOG800-nptII-sts-eyfp/IV2 was used to introduce the stilbene synthase gene, sts, in SCCs. To evaluate sts transformation of SCC, genomic DNA was extracted and primers for the marker transgenes as wells as specific primers to amplify 35s-sts (specific primers for the transgenic sts) were used to run PCRs. To study the effect of this gene, the production of trans-resveratrol was quantified and the expression of the endogenous and transgenic genes was studied after elicitation with CD and/or MJ. To do this RNA was isolated, cDNA synthetized and amplified with specific primers for the sts transgene in a real-time quantitative PCR. Results: An efficient transformation protocol has been developed for undifferentiated Monastrell SCC using Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated transformation (SAAT). The plating cell density, selective agent, and the development stage of the SCC were crucial factors for the transformation efficiency. Best results were obtained when cells were infected at the exponential phase and were plated with high cell density (500mg/dish) after co-culture on paramomycin selection medium. This protocol was used for introducing sts genes to Monastrell SCC, and more than 50 transgenic SCC lines containing sts were obtained. These transgenic cells were elicited with CD and/or MJ in order to improve the production of trans-resveratrol, and one line (F2) produced the higher level of trans-resveratrol in comparison with other transgenic and non-transgenic cell lines. In the F2 transgenic SCC, although the expression profile of sts gene (endogenous + transgenic) was similar to the expression profile detected for the endogenous sts gene in non-transgenic cell line, the levels of sts expression were much higher in the transgenic line. In fact, the expression levels of sts gene were higher at 6 h of cultivation in all treatments tested and then, quickly decreased. However, sts gene expression increased its levels at 72 h of cultivation in elicited conditions with CD and MJ in combination and then, it was maintained until the end of the experiment. Conclusions: We have developed for the first time, a transformation protocol to be applied to undifferentiated Vitis vinifera cell cultures which is based on the use of a Sonication-Assisted Agrobacterium-mediated Transformation method and on the optimization of all the factors which control the transformation efficiency (specifically growth phase of cells, plating cell density and the selection media with antibiotics). The efficient transformation system developed in this study has been used for the introduction of genes involved in the secondary metabolism in the grapevine cells. Using elicitation with CD and MJ as the second strategy to improve the production of trans-resveratrol, we have obtained a transgenic cell line which produced high levels of trans-resveratrol. Therefore, elicited transgenic suspension-cultured cells of Vitis vinifera cv Monastrell could be used for the sustainable production of a high-level of trans-resveratrol.