Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/52831

Title: Functional characterization of mast cells and histamine in the immune system of gilthead seabream (Sparus aurata L.) = Caracterización funcional de las células cebadas y de la histamina en el sistema inmunitario de dorada (Sparus aurata L.)
Issue Date: 27-Apr-2017
Date of creation: 30-Mar-2017
Related subjects: CDU::5 - Ciencias puras y naturales::59 - Zoología
Keywords: Células
Fisiología
Peces
Histamina
Teleósteos
Fisiología animal
Abstract: El sistema inmunitario de peces teleósteos ha sido estudiado durante décadas y, a pesar de haberse realizado importantes avances en su conocimiento, todavía hoy existen grandes lagunas, especialmente sobre la presencia y la función de las células cebadas (MCs) y la histamina. La dorada (Sparus aurata L.), pez teleósteo marino de alto valor comercial en la acuicultura mediterránea, ha sido utilizado por numerosos autores en el estudio de la respuesta inmunitaria de peces. Además, y debido al hecho de que la dorada es una especie hermafrodita, muchos estudios se han centrado en el efecto que el estrógeno sintético 17α-etinilestradiol (EE2), ampliamente distribuido en los ambientes acuáticos, ejerce sobre ella. Sin embargo, ninguno de estos estudios se ha centrado en los leucocitos peritoneales. Con estos precedentes, el objetivo de esta tesis ha sido avanzar en el conocimiento del papel de las MCs y la histamina en la respuesta inmunitaria de la dorada. En el primer capítulo desarrollamos un protocolo de aislamiento de MCs peritoneales de dorada. Utilizando gradientes de centrifugación y densidad, cultivos celulares, separación celular activada por magnetismo y anticuerpos monoclonales específicos (mAb) se obtuvieron fracciones de MCs con un 95% de pureza. Las MCs peritoneales aisladas presentan histamina, la cual es liberada utilizando el compuesto 48/80 (Co 48/80), clásico activador de células cebadas. Además, la expresión de los genes il1b e il8 se induce en estas células tras estimularlas con ADN bacteriano. Este protocolo de aislamiento de MCs permitirá avanzar en el conocimiento de la evolución de los mecanismos inflamatorios de vertebrados. En el segundo capítulo, estudiamos el efecto de la histamina y del Co 48/80 en la respuesta inmunitaria innata y adaptativa de dorada. Para ello, inyectamos vía intraperitoneal histamina o Co 48/80, solos o combinados con el patógeno Vibrio anguillarum, y se analizó su efecto en el exudado peritoneal y en el riñón cefálico. La histamina y el Co 48/80 alteran el porcentaje de leucocitos peritoneales y de riñón cefálico, incrementan la producción de ROS y alteran la producción específica de IgM contra V. anguillarum. Además, ambos compuestos reducen la expresión del gen que cifra el receptor 2 de histamina en leucocitos peritoneales. Estos resultados demuestran que aunque la administración sistémica de histamina y Co 48/80 es segura, ninguno de los dos compuestos puede ser considerado como un adyuvante eficiente en la vacunación intraperitoneal de dorada. En el tercer capítulo, produjimos y caracterizamos un mAb, GB10, que reconoce específicamente MCs de dorada. GB10 marca el 20-30% de los leucocitos peritoneales. GB10 induce rápidamente la muerte de las MCs de dorada, como demostramos mediante citometría de flujo. Ensayos in vivo, en los que GB10 será intraperitonealmente inyectado en dorada, nos ayudarán a comprender aspectos evolutivos tanto de las MCs como de la histamina. Finalmente, en el cuarto capítulo, analizamos el efecto de EE2 en la respuesta inmunitaria peritoneal de dorada. El EE2 fue administrado en la dieta de juveniles de dorada durante 76 días que fueron inyectados intraperitonealmente con hemocianina y aluminio como adyuvante al final del tratamiento y 92 días después. La administración en dieta del EE2 induce la expresión de los genes que cifran los receptores de estrógenos, el nuclear α y el acoplado a la proteína G1. De manera interesante, la administración en dieta del EE2 indujo una respuesta inflamatoria en el exudado peritoneal que se mantuvo durante varios meses después de finalizar el tratamiento, además de modular la expresión de los genes que cifran los receptores de histamina. En conjunto, este estudio proporciona nueva información sobre la disrupción endocrina inmunitaria, centrada en los leucocitos peritoneales. The immune system of teleost fish has been studied for decades but, despite the important advances made in our related knowledge, much is still unknown, especially about the presence and role of mast cells (MCs) and histamine. The gilthead seabream (Sparus aurata L.), a marine teleost fish of great commercial value in the Mediterranean aquaculture, has been widely used for better understanding the fish immune response. Moreover, and due to the fact that the gilthead seabream is a hermaphrodite specie, many studies has focus on the effects that the synthetic estrogen 17α-ethinylestradiol (EE2), widespread in the aquatic environment, exerts in this specie. However, no studies have been focused on peritoneal leukocytes. Within the above framework, the aim of this thesis has been to advance our knowledge of the role of MCs and histamine in the immune response of the gilthead seabream. The first chapter ended up with the development of a protocol to isolate peritoneal MCs of gilthead seabream. Using discontinuous density gradient centrifugations, cell culture, magnetic-activated cell sorting, and specific monoclonal antibodies (mAb), 95% pure MC fractions were obtained. Isolated peritoneal MCs possess histamine which is released by the compound 48/80 (Co 48/80), the classical mast cell activator. Moreover, IL-1β and IL-8 gene expression was induced in these cells by stimulation with bacterial DNA. This MC isolation protocol will be useful in the knowledge advance of the vertebrate inflammatory mechanisms evolution. In the second chapter, we study the effect of histamine and Co 48/80 on the innate and adaptive immune response of gilthead seabream. For this purpose, histamine and Co 48/80 were intraperitoneally injected alone or combined with the pathogen, Vibrio anguillarum, and their effects on peritoneal exudate and head kidney were analyzed. Histamine and Co 48/80 alter the percentage of peritoneal exudate and head kidney immune cells, increase the ROS production by peritoneal leukocytes and impair the humoral adaptive immune response, i.e. production of specific IgM to V. anguillarum. Moreover, both, histamine and Co 48/80, reduce the expression of the gene encoding histamine receptor 2 in peritoneal leukocytes. These results show that although systemic administration of histamine and Co 48/80 is safe, neither histamine nor Co48/80 can be regarded as efficient adjuvants for gilthead seabream intraperitoneal vaccination. In the third chapter, we report the production and characterization of a mAb, GB10, which specifically recognizes gilthead seabream MCs. GB10 reacted with 20-30% of peritoneal leukocytes. GB10 rapidly induce death of gilthead seabream MCs, as demonstrated by flow cytometry. In vivo assays, in which GB10 will be intraperitoneally injected in gilthead seabream, will help to understand the evolutionary aspects of both MCs and histamine. Finally, in the fourth chapter, we analyze the effects of EE2 in the peritoneal immune response of gilthead seabream. Juvenile fish were fed a pellet diet supplemented with EE2 for 76 days and intraperitoneally injected with hemocyanin plus imject alum adjuvant at the end of EE2 treatment and 92 days later. The dietary intake of EE2 induces the expression of genes encoding for the nuclear estrogen receptor α and the G protein-coupled estrogen receptor 1 in the peritoneal leukocytes. Interestingly, the dietary intake of EE2 induced an inflammatory response in the peritoneal exudate, which was largely maintained for several months after the cessation of the treatment and, besides, modulates histamine receptor gene expression. Taken together, the study provides fresh information about endocrine immune disruption, focusing on peritoneal leukocytes.
Primary author: Gómez González, Nuria Esther
Director: García Ayala, Alfonsa
Sepulcre Cortés, Mª Pilar
Faculty / Departments / Services: Escuela Internacional de Doctorado
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/52831
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 221
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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