Adaptive optics and pulse compression in multiphoton microscopy : applications to ocular tissues= Óptica adaptativa y comprensión de pulsos en microscopía muiltifotónica: aplicaciones en tejidos oculares

Abstract

Durante las dos últimas décadas las técnicas de microscopía multifotónica (o no lineal), entre ellas la fluorescencia a 2 fotones (TPEF, del inglés Two-Photon Excitacion Fluorescence) y la generación de segundo armónico (SHG, del inglés Second Harmonic Generation), se han convertido en potentes herramientas para la visualización de tejidos biológicas. Dichas técnicas permiten el registro de imágenes de capas profundas de las muestras debido a su confocalidad intrínseca. Sin embargo, las aberraciones del sistema óptico y del propio tejido limitan la calidad de la técnica. La calidad de las imágenes registradas se reduce progresivamente conforme los planos se sitúan más dentro de la muestra. La incorporación de óptica adaptativa permite la manipulación del frente de onda para minimizar el impacto de dichas aberraciones y restaurar la calidad de imágenes. Por otra parte, la dispersión óptica de los componentes del microscopio así como de la propia muestra, hacen que las componentes espectrales de los pulsos ultracortos utilizados viajen a diferentes velocidades. Esto se traduce en un ensanchamiento temporal de los pulsos que reduce la eficiencia de los procesos multifotónicos. Para compensar estos efectos de dispersión normalmente se utilizan los compresores de pulsos, capaces de modificar la fase de los diferentes componentes de frecuencia de los pulsos y comprimirlo temporalmente. En ese sentido la presente Tesis Doctoral se concentra en mejorar las imágenes de microscopia multifotónica mediante manipulaciones espaciales y temporales de un haz láser ultrarrápido ultraintenso por medio de la corrección de aberraciones y la compresión de pulsos, respectivamente. Para corregir el frente de onda se ha utilizado un modulador espacial de cristal líquido y un espejo deformable. Para optimizar las propiedades temporales de los pulsos de luz se ha empleado un compresor de pulsos variable. Se ha prestado especial atención a los efectos producidos en las imágenes multifotónicas de los tejidos oculares. Los principales objetivos de este trabajo son los siguientes: • Manipulación controlada del frente de onda del haz láser para mejorar plano a plano las imágenes de microscopía multifónica de tejidos gruesos. • Análisis de los efectos de diferentes parámetros sobre la corrección de la frente de onda: profundidad del plano, tamaño de la imagen registrada y secuencia de los coeficientes de Zernike utilizados. • Estudio del efecto de la aberración esférica en función de la profundidad de la muestra. • Determinación de un valor global de aberración esférica que permita la optimización de imágenes multifotónicas de muestras gruesas enteras y así evitar correcciones individuales plano a plano. • Pre-compensación temporal del pulso para mejorar la calidad de las imágenes de microscopía multifotónica. • Evaluación de la reducción de la potencia del láser necesaria para minimizar el daño en muestras biológicas durante el uso de la compresión de pulsos.

Estructura de la Tesis La presente Tesis Doctoral se divide en 6 capítulos que se describen de forma somera a continuación. El Capítulo 1 incluye una descripción general de las diferentes técnicas de microscopía, especialmente de la microscopía multifotónica, así como de los láseres de femtosegundos. También se revisan los conceptos de óptica adaptativa y de compresión temporal de pulsos. En el Capítulo 2 se describe el microscopio multifotónico aquí utilizado. El sistema combina un microscopio invertido con un láser de femtosegundos, una unidad de escaneo, un motor-Z y una unidad de detección. Las señales TPEF y SHG se registraron en reflexión utilizando un objetivo de no inmersión. El Capítulo 3 se centra en el desarrollo de una técnica de óptica adaptativa sin sensor de frente de onda utilizando un algoritmo de tipo hill-climbing (o “aproximaciones sucesivas”) con el objeto de mejorar la calidad de las imágenes obtenidas con el microscopio multifotónico descrito en el Capítulo 2. Como elemento adaptativo se utiliza un modulador espacial de cristal líquido con el que se generan los modos de Zernike de forma sistemática durante el registro de imágenes. Un método alternativo para aumentar la profundidad de foco en microscopía multifotónica se presenta en el Capítulo 4. La técnica se basa en la manipulación del patrón de aberración esférica del haz incidente con un módulo de óptica adaptativa utilizando un espejo deformable y un sensor de Hartmann-Shack. En el Capítulo 5 se estudian de los efectos sobre la calidad de las imágenes multifotónicas de una técnica de pre-compresión temporal de pulsos a través de un compresor variable formado por una pareja de prismas. La configuración óptima del compresor de pulsos se determinará con un procedimiento basado en el registro de tomografías de las muestras bajo estudio. Adicionalmente, se presenta un método simple basado en la reducción de la potencia del láser para evitar producir daño sobre las muestras biológicas cuando se utilizan técnicas de compresión de pulsos. Finalmente el Capítulo 6 contiene las conclusiones de este trabajo.

Conclusiones de la Tesis 1. Se ha desarrollado un microscopio multifotónico que incluye un modulador espacial de cristal líquido en la vía de iluminación para corregir plano a plano las aberraciones inducidas por la muestra. El procedimiento experimental se basa en una técnica de óptica adaptativa sin sensor de frente de onda y un algoritmo tipo hill-climbing. A pesar de utilizar un objetivo en aire con baja apertura numérica y una configuración de microscopio en reflexión, el método es capaz de generar imágenes TPEF y SHG con calidad notablemente mayor. 2. Aunque la corrección de óptica adaptativa es particular para cada muestra, la cantidad de aberración aumenta linealmente con la profundidad. Por otra parte, el frente de onda que optimiza la imagen en una zona determinada no depende del área registrada. Sin embargo, esto puede depender de la estructura de la muestra y la profundidad del plano de interés. 3. La combinación de los modos de Zernike que optimiza la imagen multifotónica depende de la secuencia de control de la corrección. El algoritmo hill-climbing es eficiente para ambas direcciones creciente y decreciente. Aunque los mapas de aberración óptimos difieren entre ambas secuencias de control, las imágenes finales mejoradas son similares. 4. Se encontró que la aberración esférica es el término de aberración dominante, especialmente en los planos más profundos de las muestras. La contribución de este término de aberración es tal, que las imágenes que proporciona son de calidad similar a las obtenidas cuando se tiene en cuenta también otros términos como el coma y el astigmatismo. 5. Se ha utilizado un módulo de óptica adaptativa compuesto por un sensor de Hartmann-Shack y un espejo deformable para manipular el patrón de aberración esférica del haz láser incidente e incrementar la profundidad de foco. 6. Utilizando imágenes de tomografía rápida se determinó un patrón de aberración esférica único y óptimo que evita la corrección plano a plano. Un único valor de aberración esférica reduce la calidad de imagen de los planos más superficiales. Sin embargo las imágenes en las capas más profundas mejoran con respecto a las condiciones originales. 7. Para pre-compensar la dispersión de los pulsos láser producidos por la óptica del microscopio y la muestra se ha usado un compresor de pulsos variable. Esta operación aumenta la eficiencia de los procesos multifotónicos de forma que las señales TPEF y SHG aumentan un factor 2x o más. 8. El estado de compresión óptimo que proporciona la mejor imagen depende de la muestra, pero para cada una de ellas es constante con la profundidad. 9. Esta operación de compresión de pulsos permite la reducción de la potencia del láser de iluminación, lo que minimiza los posibles efectos secundarios no controlados de daño térmico o de foto-blanqueo (del inglés photo-bleaching). Esto es de vital importancia en muestras biológicas, más propensas a este tipo de daño. Los resultados muestran que la operación de compresión permite una reducción de la potencia de aproximadamente un 50%. Summary During the last two decades multiphoton (or nonlinear) microscopy, including two photon excitation fluorescence (TPEF) and second harmonic generation (SHG), has become a powerful tool for visualization of biological tissue. Such techniques allow the registration of images of deeper layers of the samples due to their inherently confocality. However, aberrations in the optical system and the specimen-induced ones limit the quality of this technique. The quality of the recorded images is progressively reduced when imaging deeper layers within the sample. The implementation of adaptive optics techniques allows the manipulation of the wavefront to minimize the impact of those aberrations and restore the quality of the images. Furthermore, the optical dispersion of the microscope components and the sample itself also affect the imaging recording technique. Due to this, different frequency components of the ultrashort pulses travel at different speed through the optics of the microscope. This leads to a temporal broadening of the pulses, which reduces the efficiency of multiphoton processes. To compensate for these dispersion effects pulse compressors are usually used, which are able to modify the phase of the different frequency components of the pulse. In that sense, this Doctoral Thesis is focused on improving multiphoton microscopy images by spatial and temporal beam manipulations of the ultra-fast ultra-intense laser beam through the correction of aberrations and pulse compression, respectively. To correct the wavefront, both a liquid-crystal spatial light modulator and a deformable mirror were used. To optimize the temporal properties of the pulses, a variable pulse compressor has been employed. Particular attention has been paid to the effects on multiphoton images of ocular tissues.