Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/50602

Title: Mecanismos moleculares de la traducción cap-independiente de MNSV: análisis estructural y funcional de los factores virales y del huésped= Molecular mechanism of cap-independent translation of MNSV: structural and functional analysis of the viral and host factors involved
Issue Date: 2-Sep-2016
Date of creation: 22-Jul-2016
Related subjects: 578 - Virología
Keywords: Virología
Infección
Abstract: La traducción cap-independiente es frecuente en ARNs virales, los cuáles carecen de estructura 5’-cap y/o cola poli(A) típicas de los ARNm eucarióticos. En su lugar, muchos virus de ARN de plantas tienen elementos de ARN en sus 3’-UTRs capaces de potenciar la traducción independiente de cap (3’-CITEs). Se ha descrito que estos 3’-CITEs se unen directamente y requieren de factores de iniciación a la traducción. (eIF) para su actividad. Hemos demostrado que la traducción cap-independiente de los ARNs del Virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) está controlada por un 3’-CITE en cis. La evidencia genética sugiere una interacción entre la subunidad eIF4E de melón y el 3’-CITE. Sin embargo, la interacción entre el 3’-CITE y eIF4E permanece sin caracterizar. El conocimiento adquirido de esta interacción podría ser usado en estrategias antivirales. De manera importante, la resistencia a MNSV se ha demostrado que está mediada por eIF4E y, recientemente, se ha identificado un nuevo aislado capaz de superar esta resistencia. Por este motivo, los objetivos de esta tesis están enfocados en esclarecer los mecanismos de traducción cap-independiente de ARNs de MNSV y la caracterización de este nuevo aislado que supera la resistencia. En el primer capítulo se ha llevado a cabo la caracterización de este nuevo aislado de MNSV capaz de superar la resistencia mediada por eIF4E. La secuencia nucleotídica del nuevo aislado, denominado MNSV-N, mostró una alta similitud con el resto de aislados de MNSV que no superan la resistencia, incluso en su 3´-UTR. Sin embargo, el inicio de su 3´-UTR contiene una inserción de 55 nucleótidos que es casi idéntica al comienzo del 3´-UTR del virus del amarilleo de las cucurbitáceas transmitido por pulgones (Cucurbit aphid-borne yellows virus) (CABYV), indicando que MNSV-N es un recombinante entre MNSV y CABYV. Mediante la construcción de virus quiméricos se localizó el determinante de virulencia de MNSV-N en su 3´-UTR. Estudios de traducción in vivo en protoplastos de melón demostraron que la inserción de 55 nt funciona como un 3’-CITE y es el responsable de la superación de la resistencia. Así mismo, se clasificó por su estructura secundaria como una nueva clase de 3’-CITE mediante la realización de Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE). En el segundo capítulo, se realizó un análisis estructural y funcional del 3’-CITE y del factor asociado a él, eIF4F, que ambos controlan la traducción de los ARNs de MNSV. Para ello, primero se delimitó a 45 nucleótidos la secuencia mímina capaz de estimular la traducción in vivo en protoplastos de melón. A continuación, estudiamos su estructura secundaria mediante SHAPE y su capacidad para unir al complejo eIF4F en ensayos de UV-Crosslinking seguido de PAGE. Los ensayos in vitro revelaron la unión a eIF4F a través de una zona desapareada del 3’-CITE. Los análisis mutacionales realizados en esa zona conllevaron con la pérdida de traducción y de unión a eIF4F. Por último, los ensayos de mutantes en eIF4E co-agroinfiltrados en trans llevados a cabo, nos sugieren que el complejo eIF4F es necesario para la traducción de estos ARNs, ya que la rotura de la interacción eIF4E:eIF4G está asociada con una pérdida de la actividad traduccional. Por último, en el tercer capítulo estudiamos el modo de interacción entre eIF4E y eIF4G ya que hemos determinado que es necesaria para la traducción de los ARNs virales de MNSV. Para ello se cristalizó la subunidad eIF4E, libre y unida a una versión truncada de eIF4G1003-1092. La difracción por rayos X de los cristales del complejo eIF4F reveló un segundo dominio de unión en eIF4G. Este segundo dominio, o dominio no-canónica, está en contacto con la superficie lateral de eIF4E, la cuál está compartida por otras proteínas que contienen también este segundo dominio de unión. Estos datos sugieren que la interacción eIF4E:eIF4G es bipartita y que hay una competición entre eIF4G y otras proteínas por estas superficies de eIF4E para regular la traducción. SUMMARY Cap-independent translation is frequent for viral RNAs, which are often devoid of 5′-cap structure or/and 3′-poly(A) tail typical of eukaryotic mRNAs. Instead, many plant RNA viruses contain in their 3´-UTRs RNA elements able to enhance their cap-independent translation (3´-CITEs). It has been reported that 3´-CITEs directly bind and require eukaryotic translation initiation factors (eIF) for their function. We have shown that cap-independent translation of Melon necrotic spot virus (MNSV, family Tombusviridae) RNAs is controlled by a 3´-CITE in cis. Genetic evidence indicates that the eIF4E subunit of melon eIF4F is necessary for cap-independent translation of avirulent MNSV RNAs. However, the interaction between 3’-CITE and eIF4E remains uncharacterized. The knowledge gained of this interaction may be used in antiviral strategies. Importantly, MNSV resistance was showed to be eIF4E-mediated and recently, a new resistance-breaking MNSV isolate was identified. Thus, the aims of this thesis is focused on elucidating the mechanisms of cap-independent translation of MNSV RNAs and characterize this new resistance- breaking isolate. In the first chapter, we characterized the newly resistance-breaking MNSV isolate, MNSV-N. It was found a 55 nucleotide insertion in its 3’-UTR which was acquired by interfamilial recombination with the 3’-UTR of an Asiatic Cucurbit aphid-borne yellows virus (CABYV, family Luteoviridae) isolate. By constructing chimeric viruses and assaying their properties, we showed that the recombined sequence is responsible for the MNSV-N ability to break down the eIF4E-mediated resistance. Analysis of the translation effiency showed that the insertion funcstions as a 3’-CITE. The structural and functional characterization of this 3’-CITE was set up by Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) and showed that it belongs to a new structural class that we called CXTE (CABYV Xinjiang-like translation element) and functions in absence of eIF4E. In the second chapter, to understand the cap-independent translation of MNSV RNAs, we performed a structural and functional analysis of the 3’-CITE of avirulent MNSV isolates and its partner eIF4F. Thus, we defined the minimal size of the 3´-CITE in “in vivo” translation assays to a sequence of 45 nucleotides. Hereafter, we studied its secondary structure by SHAPE and its ability to bind eIF4F by UV-crosslinking and footprinting assays. In vitro binding assays revealed eIF4F-binding sites on a bulge of 3’-CITE. Mutational analyses in eIF4E revealed amino acids involved in cap-independent translation and suggested that the eIF4F complex is necessary for an efficient translation because the disruption of the complex is associated with a loss in translation activity. Finally, in the third chapter we studied the binding mode of the eIF4E:eIF4G interaction. We previously showed that this binding is required for MNSV RNAs efficiently translate. Thus, subunit eIF4E free and in complex with a truncated eIF4G1003-1092 were crystallized. X-ray data revealed a second eIF4E-binding domain in eIF4G. This second binding domain, or non-canonical binding motif, contacts with the lateral surface of eIF4E which it is shared with other eIF4E-binding proteins (4E-BPs). This data suggests a bipartite eIF4E:eIF4G binding mode that competes with 4E-BPs in translation regulation.
Primary author: Miras Marín, Manuel
Director: Truniger Rietmann, Verónica
Aranda Regules, Miguel A.
Faculty / Departments / Services: Escuela Internacional de Doctorado
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/50602
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 171
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
Appears in Collections:Ciencias

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