Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/50519

Title: Analysis and discrimination between substrates and inhibitors of tyrosinase= Análisis y discriminación entre sustratos e inhibidores de tirosinasa
Issue Date: 20-Jul-2016
Date of creation: 1-Jul-2016
Related subjects: 577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
Keywords: Enzimas
Bioquímica
Abstract: OBJETIVOS: Los objetivos fundamentales de esta Tesis Doctoral consisten en la profundización en el mecanismo de actuación e inhibición de la enzima tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa, además del establecimiento de una metodología que permita discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de la enzima. También la identificación y caracterización cinética como sustratos de algunas de las moléculas descritas como inhibidores de tirosinasa y usadas como tales en la industria cosmética y / o alimentaria. METODOLOGÍA: Ensayos espectrofotométricos, para realizar medidas de actividad monofenolasa y difenolasa de tirosinasa y estudiar su inhibición; ensayos oximétricos, para realizar medidas de actividad de tirosinasa siguiendo el consumo de oxígeno, cosustrato de la enzima; ensayos de RMN, para determinar los valores de desplazamiento químico los átomos de carbono de las moléculas de interés; ensayos de simulación, para comprobar la validez de los resultados obtenidos experimentalmente; docking computacional, para entender los modos de unión de tirosinasa a distintos ligandos; cromatografía de proteínas en FPLC, para la purificación de la tirosinasa comercial; análisis por regresión lineal y no lineal. CONCLUSIONES: Se ha establecido un diseño experimental que permite discernir entre moléculas fenólicas inhibidoras y sustratos alternativos de tirosinasa, teniendo en cuenta las actividades monofenolasa y difenolasa de la enzima. Las medidas de actividad monofenolasa se deben realizar añadiendo al medio de reacción la cantidad de o-difenol necesaria para suprimir el periodo de retardo que aparece al inicio de los registros de actividad. Siguiendo esta metodología, se han identificado los compuestos alcohol p-hidroxibencílico, tirosol, floretina y floricina como sustratos alternativos de tirosinasa. Se han identificado como sustratos de la enzima a los compuestos 4-hexilresorcinol, descrito como inhibidor y usado en la industria cosmética y alimentaria como despigmentante y antipardeante, y oxiresveratrol, propuesto para los mismos fines debido a su ya descrito efecto inhibidor sobre esta enzima. Estas moléculas son hidroxiladas por la enzima y posteriormente oxidadas a una o-quinona que rápidamente isomeriza a una p-quinona, más estable. Además, estos sustratos han sido caracterizados cinéticamente, llegando a la obtención de los parámetros cinéticos KM (constante de Michaelis) y kcat (constante catalítica). Mediante métodos espectrofotométricos se ha identificado como sustrato de tirosinasa al ácido elágico, compuesto descrito como inhibidor y usado como despigmentante en la industria cosmética. Se ha llevado a cabo su caracterización cinética como sustrato, llegando a la obtención de los valores de KM y kcat. Se ha determinado que el ácido elágico inhibe la ruta de biosíntesis de melaninas por su efecto antioxidante, reaccionando con el anión superóxido, las o-quinonas y semiquinonas producidas durante el proceso. Se investigó el mecanismo de actuación de inhibidores análogos a sustratos fenólicos de tirosinasa, llegando a la conclusión de que aquellos que producen el mismo grado de inhibición en las actividades monofenolasa y difenolasa, se unen a las mismas especies enzimáticas en ambas actividades, siendo el tipo y las constantes de inhibición aparentes también similares. Se estableció una metodología para el estudio de inhibidores de tirosinasa y se observó que los valores de muestran una ligera dependencia de la naturaleza del sustrato, a través de las constantes k2 y k6. Finalmente, se estudió el efecto del pH en la catálisis de tirosinasa. Se propuso que un grupo con un pKa de 4.63 ± 0.04 podría ser el responsable de dicho efecto. Este grupo podría corresponder al ácido glutámico E322, que controlaría el acceso de los sustratos al sitio activo según su estado de protonación. Los protones actúan como inhibidores competitivos, uniéndose a las formas metatirosinasa y oxitirosinasa. El pKa de los hidroxilos fenólicos y la carga de grupo R también son importantes. ABSTRACT OBJECTIVES: The main objectives of this report are (1) to investigate further the mechanisms of action and inhibition of tyrosinase enzyme, considering the monophenolase and diphenolase activities, (2) to establish a methodology in order to distinguish phenolic inhibiting molecules from alternative substrates of the enzyme, and finally, (3) to identify and kinetically characterize as substrates some molecules described as inhibitors in the scientific literature and used as such in the cosmetic and food industries. METHODOLOGY: Spectrophotometric assays, to measure the monophenolase and diphenolase activities of tyrosinase and study its inhibition; oxymetric assays, to measure tyrosinase activity by following the oxygen consumption (oxygen is a cosubstrate of the enzyme); RMN assays, to determine carbon atom chemical shift values of the molecule of interest; simulation assays, to test the validity of the experimental results; computational docking, to understand the binding modes of tyrosinase with different ligands; protein chromatography in FPLC equipment, to purify commercial tyrosinase; lineal and non-lineal regression. CONCLUSIONS: An experimental design has been established which permits to distinguish inhibiting phenolic molecules from alternative substrates of tyrosinase, considering the monophenolase and diphenolase activities of the enzyme. The measurements of the monophenolase activity should be made by adding the quantity of o-diphenol, needed to abolish the lag period at the beginning of the activity recordings, to the reaction medium. The compounds p-hydroxybenzyl alcohol, tyrosol, phloretin and phloridzin have been identified as alternative substrates of tyrosinase, by following this methodology. The compounds 4-hexylresorcinol, described as inhibitor and used in the cosmetic and food industries as a depigmenting and anti-browning agent, and oxyresveratrol, proposed for the same purposes due to the described inhibitory effect on this enzyme, have been identified as tyrosinase substrates. These molecules are hydroxylated by the enzyme and subsequently oxidized to an o-quinone, which rapidly isomerizes to a more stable p-quinone. Moreover, these substrates have been kinetically characterized, obtaining the kinetic parameters KM (Michaelis constant) and kcat (catalytic constant). Ellagic acid, a compound described as inhibitor and used as a depigmenting agent in the cosmetic industry, has been identified as a tyrosinase substrate by spectrophotometric methods. Its kinetic characterization as a substrate has been carried out, obtaining the KM and kcat values. It has been determined that ellagic acid inhibits the melanin biosynthesis pathway due to its antioxidative effect, by reacting with superoxide anions, o-quinones and semiquinones produced during the process. The action mechanism of inhibitors which are analogous to phenolic substrates was studied. We concluded that those inhibitors which produce the same degree of inhibition on the monophenolase and diphenolase activities, bind to the same enzymatic species in the two activities, being the type and the apparent inhibition constants the same too. A methodology was established in order to study tyrosinase inhibitors. It was observed that values show a slight dependence on the substrate nature, through the constants k2 and k6. Finally, the pH effect on the catalysis of tyrosinase was studied. It was proposed that a group with a pKa value of 4.63 ± 0.04 might be responsible for this effect. This group could correspond to the glutamic acid E322, which would control the substrate access to the active site depending on its protonation state. Protons act as competitive inhibitors, binding to the met-tyrosinase and oxy-tyrosinase forms. The pKa value of the phenolic hydroxyl groups and the charge of the R group are important too.
Primary author: Ortiz Ruiz, Carmen Vanessa
Director: García Cánovas, Francisco
Tudela Serrano, José
Faculty / Departments / Services: Facultad de Biología
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/50519
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 216
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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