Study of the therapeutic effect of human Wharton's jelly mesenchymal stem cells in an experimental Murine model of wound healing = Estudio del efecto terapéutico de las células mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano en un modelo Murino de cicatrización de heridas

Abstract

Introducción: La piel es el órgano más extenso del cuerpo humano. Las heridas cutáneas son producto de la ruptura de la integridad de la piel. Las células mesenquimales (MSCs) están emergiendo como fuertes candidatas para ser usadas como terapia celular en el tratamiento de heridas crónicas, dado su enorme potencial para mejorar la reparación y regeneración de los tejidos posterior a una lesión. Constructos biosintéticos fabricado con la fibroína de la seda celularizados con MSCs de diferentes fuentes han demostrado ser eficaces en la curación de heridas experimentales de la piel. Objetivos: investigar el comportamiento de las células mesenquimales de la gelatina de Wharton del cordón umbilical humano (hWj-MSCs) tanto in vitro como in vivo tras ser sembradas en un constructo electrohilado compuesto de fibroína de la seda y posteriormente implantado en ratones inmunocompetentes. Determinar si las hWj-MSCs aplicadas mediante constructos de fibroína de seda en heridas creadas en el dorso de ratones SKH1 contribuyen a mejorar la cicatrización de la lesión. Metodología: inicialmente hemos puesto a punto el protocolo para el aislamiento y caracterización de las hWj-MSCs. Posteriormente, estas MSCs en combinación con un constructo fabricado a partir de la fibroína de la seda fueron utilizados para probar sus propiedades terapéuticas en un modelo murino experimental de heridas. Resultados: Las hWj-MSCs mostraron una morfología fibroblástica, y presentaron en su superficie la expresión de marcadores mesenquimales que fueron positivos para CD90, CD105, CD73, y sin presencia detectable de marcadores de células hematopoyéticas. Las hWj-MSCs mostraron una capacidad limitada para diferenciarse hacia adipocitos, condrocitos, y osteoblastos. Las hWj-MSCs inhibieron de forma significativa la proliferación de linfocitos T tras ser estimulados con esferas anti-CD3/CD28, así como con células dendríticas maduras alogénicas. Las hWj-MSCs disminuyeron la producción in vitro de la citoquina pro-inflamatoria IFN- por los linfocitos T activados. Este efecto inmunosupresor también estuvo mediado por la producción de los factores anti-inflamatorios TGF-, IDO, y PGE2. Los experimentos con cultivos mixtos de linfocitos en presencia de diferentes inhibidores específicos de la biosíntesis o la señalización de estos factores anti-inflamatorios tales como SB-431542, indometacina (IDM), o 1-metil-triptófano (1-MT) respectivamente, recuperaron casi en su totalidad el nivel de proliferación de las células T estimuladas con células dendríticas maduras. El tratamiento de las heridas de la piel en ratones SKH1 demostró que la combinación de hWj-MSCs y el constructo de fibroína de la seda mejoró significativamente la capacidad de cicatrización de heridas. Conclusiones: Las hWj-MSCs son poco inmunogénicas, no expresan moléculas coestimuladoras, y expresan citoquinas que pueden modular la función inmune. La combinación de hWj-MSCs con los constructos de fibroína de seda contribuyó a la generación de un tejido de granulación de alta calidad, y escasa formación de tejido cicatrizal. La gelatina de Wharton del cordón umbilical humano puede ser una fuente adecuada para la obtención de MSCs para ser utilizadas en la cicatrización de heridas debido a sus diversas ventajas y junto con los beneficios sinérgicos de un constructo pudieran conformar una combinación ideal como apósitos para heridas crónicas de lenta y difícil curación. Introduction: the skin is the largest organ in the human body. Cutaneous wounds are the result of disrupted skin integrity. Mesenchymal stem cells (MSCs) are emerging as a promising candidate for cell-based therapy for the treatment of chronic wounds because of their enormous potential for enhancing tissue repair and regeneration following injury. Silk fibroin cellularized with MSCs from different sources has been shown to be effective in repairing experimental wounds of the skin. Objectives: to investigate the behavior of Wharton’s jelly mesenchymal stem cells (Wj-MSCs) both in vitro and in vivo when cultivated on electrospun silk fibroin scaffolds and implanted in immunocompetent mice. To determine whether Wj-MSCs delivered in silk fibroin scaffolds into skin defects in SKH1 mice would contribute to dermal wound healing. Methodology: we have first standardized the protocol for the isolation and characterization of Wj-MSCs. Further, these MSCs along with the combination of silk fibroin scaffolds were used to test their wound healing properties by creating skin wounds in an experimental murine model. Results: Wj-MSCs exhibited a fibroblastic morphology and displayed MSC surface markers positive for CD90, CD105, CD73 with no detectable presence of hematopoietic cells markers. Wj-MSCs were limited on their ability to differentiate into adipocytes, chondrocytes, and osteoblasts. Wj-MSCs suppressed T cell proliferation after stimulation with anti-CD3/CD28 coated beads and allogeneic mDCs. Wj-MSCs downmodulated the in vitro production of the pro-inflammatory cytokine IFN- by activated T lymphocytes. This immunosuppressive effect was also mediated by the production of the anti-inflammatory cytokines TGF-, IDO, and PGE2. MLCs experiments in the presence of different specific inhibitors of the biosynthesis or signaling of these anti-inflammatory factors such as SB-431542, indomethacin (IDM) or 1-methyl-tryptophan (1-MT), respectively, recovered almost entirely the proliferation rate of mDCs-stimulated T cells. Treatment of skin injury of SKH1 mice model demonstrated that combination of Wj-MSCs and silk fibroin scaffold exhibited significantly better wound-healing capabilities. Conclusions: Wj-MSCs have reduced immunogenicity, did not express costimulatory molecules, and express cytokines that may modulate immune function. Wharton's jelly MSCs combined with silk fibroin scaffolds in the wound bed contributed to the generation of a high-quality, well-vascularized granulation tissue, enhanced re-epithelialization of the wound, and attenuated the formation of fibrotic scar tissue. Wharton's jelly from the human umbilical cord may be an adequate source for obtaining MSCs for wound healing given its several advantages and together with the synergistic benefits of a nanoscaffold they make ideal combinations as wound dressings for slow healing and hard-to-heal chronic wounds.