Polarización y microscopía multifotónica para el análisis de estructuras oculares

Abstract

La microscopía multifotónica, y en particular la generación de segundo armónico SHG (del inglés Second Harmonic Generation) constituye una potente herramienta para la visualización de tejidos biológicos formados por colágeno. La técnica es intrínsecamente confocal y permite el registro de imágenes de capas profundas de las muestras, con baja foto-toxicidad sobre el tejido. Para el estudio de la organización de dichos tejidos, la microscopía SHG se ha combinado con el análisis de Fourier o con técnicas de polarización. Éstas han permitido tanto la mejora de la calidad de las imágenes SHG, como el desarrollo de métodos para el diagnóstico y seguimiento de enfermedades asociadas a desórdenes del colágeno. En esta Tesis Doctoral se propone el uso del tensor de estructura como método para el cálculo de parámetros de isotropía sobre la imagen SHG. En tejidos oculares formados por colágeno, dicha herramienta se ha usado para la caracterización de la organización global de las fibras y la clasificación objetiva en función de su distribución espacial: cuasi-alineados, parcialmente organizados, organización con dos direcciones preferentes y desorganizados. En segundo lugar, se ha desarrollado un modelo teórico de la intensidad de la señal SHG en colágeno en función de la polarización incidente. La comparación entre dicho modelo y los resultados experimentales en muestras de colágeno con diferentes grados de organización no sólo ha permitido comprobar la fiabilidad del modelo, sino también obtener una expresión analítica para el cálculo de la organización interna, y establecer su relación con la organización externa del colágeno. Además, la modulación de la señal SHG en función de la polarización se ha utilizado como método diferencial en el proceso patológico conocido como queratocono corneal. Finalmente, se ha aplicado con éxito el formalismo de Stokes-Mueller para, en primer lugar, estudiar la relación entre la diatenuación y la organización del colágeno (tanto externa como interna) y, en segundo lugar, para mejorar la visualización de dichas estructuras. Multiphoton microscopy, and in particular Second Harmonic Generation (SHG), provides a powerful tool for collagen-based tissues imaging. The technique is intrinsically confocal, allowing the imaging of deeper layers of the sample with reduced photodamage. SHG microscopy has been combined with Fourier analysis and polarization techniques to study tissue organization. These procedures led to both SHG image improvement and the development of methods for diagnosis and tracking of pathologies related to collagen disorders. Throughout this PhD Thesis, the structure tensor is proposed as a method to compute the isotropy across SHG images. Its application to collagen-based ocular tissues has achieved the characterization of the global organization of their fibers, as well as an objective classification as a function of their spatial distribution (quasi-aligned, partially organized, organized along two preferred orientations and non-organized collagen samples). A theoretical model for the computation of the SHG signal intensity from collagen, as function of the incident polarization, has been developed. The comparison between numerical simulations and experimental results in collagen samples with different degrees of organization, permitted to test the reliability of the model and to obtain an analytical expression to calculate the internal organization and establish a relationship with the external organization. The modulation of the SHG signal as function of the incident polarization could be employed as a technique to differentiate pathological keratoconic corneas from healthy ones. Finally, the Stokes-Mueller formalism has successfully been applied to study the relationship between diattenuation and collagen organization (both internal and external) and to improve the visualization in such structures.