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dc.contributor.advisorCánovas Díaz, Manuel-
dc.contributor.advisorBernal Sánchez, Vicente-
dc.contributor.authorPastor Hernández, José María-
dc.contributor.otherFacultad de Químicaes
dc.date.accessioned2016-02-09T11:23:20Z-
dc.date.available2016-02-09T11:23:20Z-
dc.date.created2015-01-22-
dc.date.issued2016-02-09-
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/10201/47813-
dc.description.abstractObjetivos: (i) Esbozar una imagen general del metabolismo central de C. salexigens a partir de la información del genoma, (ii) determinar los principales flujos extracelulares (asimilación de carbono, excreción de subproductos) y de síntesis de sus solutos compatibles, las ectoínas, y analizar el efecto de la salinidad sobre dichos flujos empleando fuentes de carbono marcadas isotópicamente, (iii) estudiar el efecto de la composición del medio (en términos de ratio C/N y tipo de fuente de nitrógeno) sobre los flujos metabólicos, síntesis de ectoínas/biomasa y excreción de subproductos y aplicar esta información en el diseño de una estrategia de cultivo que maximice la producción de biomasa/ectoínas, (v) analizar el efecto del uso de fructosa como fuente de carbono sobre la fisiología de C. salexigens y (vi) identificar las rutas de consumo de fructosa y demostrarlas experimentalmente. Metodología: Se aplicó HPLC para identificación y cuantificación de metabolitos y ectoínas, 13C-RMN para cuantificación de ectoínas y rastreo de marcaje isotópico y 31P-RMN para medida de actividad enzimática en extractos crudos. Se usaron métodos espectrofotométricos para medida de actividades enzimáticas (en extractos crudos y en proteínas purificadas). Se aplicó RT-PCR en determinaciones de expresión génica y técnicas de biología molecular en la clonación y expresión heteróloga de genes de C. salexigens en E. coli. Resultados: Se llevan a cabo cultivos crecidos en glucosa a diferentes salinidades que muestran una menor eficacia metabólica a baja salinidad, en forma de metabolismo overflow (excreción de piruvato y acetato), menor síntesis de biomasa y mayor velocidad de consumo de glucosa. Los estudios con glucosa marcada con 13C indican que i) C. salexigens carece de ruta glucolítica funcional, metabolizando la glucosa casi exclusivamente mediante la ruta de ED, debido a la probable falta de una enzima Pfk funcional, ii) el nivel de anaplerosis es alto en comparación con microorganismos relacionados, iii) algunos flujos relativos clave del metabolismo central no se alteran con la salinidad, lo que implica una rigidez metabólica que podría justificar la presencia de overflow a baja salinidad. En cultivos con distintas ratios C/N, se observa un mayor nivel de overflow en ratios C/N altas (fuente de nitrógeno limitante). La eficacia en síntesis de ectoínas es mayor en medio con menor cantidad de fuente de carbono (glucosa) y de nitrógeno (amonio). Estos resultados se aplican al diseño de una estrategia de cultivo fed-batch en dos fases, con la que se consigue alcanzar alta densidad celular y eliminar el overflow. La ratio C/N no afecta a las ratios de flujos centrales confirmando la rigidez metabólica. En cultivos con fructosa como fuente de carbono se observa la ausencia de overflow y mayor síntesis de biomasa. El empleo de fructosa marcada con 13C confirma la presencia de dos rutas para el catabolismo de la fructosa en C. salexigens: la ruta de ED, mayoritaria, y la ruta de EMP que contribuye en un 15-20% del flujo. Conclusiones: La glucólisis no es funcional debido a la carencia de Pfk, y la glucosa se asimila mediante la ruta de ED, más eficaz en producción de NADPH; existe un alto nivel de anaplerosis. Estos datos apuntan a una adaptación al gran esfuerzo anabólico para síntesis de ectoínas. El metabolismo central del carbono es rígido, sus flujos relativos no varían con la salinidad, ni con la proporción C/N en el medio. Esta rigidez hace el metabolismo menos eficiente en medios pobres en fuente de nitrógeno y con baja salinidad. Esto indica una adaptación a ambientes pobres en nutrientes. Las condiciones en las que el metabolismo es menos eficiente dan lugar a un menor crecimiento, y la aparición de metabolismo overflow. C. salexigens metaboliza la fructosa mediante dos rutas: las rutas de ED y EMP. ED es mayoritaria, debido a las altas necesidades de cofactores reducidos. La disponibilidad adicional de la ruta de EMP hace al metalismo en fructosa más eficiente que en glucosa, lo que se traduce en ausencia de overflow en fructosa, y mayor síntesis de biomasa. Objectives: (i) Drawing a draft of central metabolism from C. salexigens based on the annotated genome, (ii) assessing the main extracellular fluxes (carbon source uptake, by-products excretion) and the synthesis of the main compatible solutes, ectoines, and analyzing the effect of salinity on such fluxes using isotopically labeled carbon sources, (iii) studying the effects of medium composition (as C/N ratio and nitrogen source) on metabolic fluxes, biomass/ectoines synthesis and by-products excretion and applying this information to devise a culture strategy able to maximize biomass/ectoines production, (v) analyzing the effect of fructose as carbon source on the C. salexigens physiology and (vi) identifying the pathways for fructose uptake and give experimental evidence of them. Methodology: HPLC was applied to identify and quantify metabolites and ectoines, 13C-NMR for ectoines quantification and isotopic label tracing and 31P-NMR for assessing enzyme activities on crude extracts. Spectrophotometric methods were applied for measuring enzyme activities (both in crude extracts and purified proteins). RT-PCR was used in gene expression experiments and molecular biology techniques for cloning and heterologous expression of genes from C. salexigens in E. coli. Results: Glucose grown cultures were performed at different salinities, showing a less efficient metabolism at low salinity as overflow metabolism (pyruvate and acetate excretion), lower biomass synthesis and higher glucose uptake rate. Studies using 13C-labeled glucose show that i) C. salexigens lacks a functional glycolytic pathway, and metabolizes glucose almost exclusively through ED pathway, which is likely due to the lack of Pfk enzyme, ii) high anaplerosis levels, compared to related microorganisms, iii) certain key flux ratios from central metabolism were not affected by salinity, involving a metabolic rigidity which could explain the presence of overflow at low salinity. Higher overflow levels are shown by cultures grown on a higher C/N ratio (limiting nitrogen source). Ectoines synthesis yield is higher when growing in media with low carbon (glucose) and nitrogen (ammonium) sources content. These results are applied to devising a two-step fed-batch culture strategy, which allowed reaching high cell density and overflow removal. C/N ratio did not affect central metabolism flux ratios, further confirming the metabolic rigidness. Lack of overflow and higher biomass yields are shown by fructose grown cultures. Using 13C-labeled fructose confirmed the existence of two alternative pathways for fructose uptake in C. salexigens: ED pathway which contributes to 80-85% of fructose uptake flux, and EMP pathway for the remaining part of carbon flux. Conclusions: Glycolysis is not present due to lack of Pfk enzyme, thus, glucose must be assimilated through ED pathway, which is more efficient in NADPH production; anaplerosis is relatively high. These results suggest C. salexigens has adapted to meet the high biosynthesis needs posed by salinity. Central metabolism is rigid, as central flux ratios were not affected by salinity or C/N ratio in growth medium. Such rigidity makes metabolism less efficient in low nitrogen and low salinity growth media. This could be understood as an adaptation to grow in nutrient-poor environments. Environmental conditions where central metabolism is less efficient lead lower growth yield due to overflow metabolism. C. salexigens can metabolize fructose by means of two different routes: ED and EMP pathways. Most of fructose is assimilated by ED pathway, due to high cofactor synthesis needs. The availability of an additional EMP route makes fructose metabolism more efficient than glucose metabolism, resulting in lack of overflow and higher biomass yields in fructose.es
dc.formatapplication/pdfes
dc.format.extent236-
dc.languagespaes
dc.relation.ispartofProyecto de investigación:es
dc.rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccesses
dc.subjectBacteriases
dc.subjectSalinidades
dc.subject.other579 - Microbiologíaes
dc.titleAdaptación del metabolismo central en el mantenimiento de la homeostasis en ambientes hipersalinos : caso del halófilo Chromohalobacter salexigenses
dc.typeinfo:eu-repo/semantics/doctoralThesises
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