Chronotoxicity of contaminants (etanol and hezvy metales) in a freshwater teleost Dario rerio (Hamilton, 1882) and marine amphipods Gammarus aequicauda (Martynov, 1931) and Gammarus chevreuxi (Sexton, 1913) = Cronotixicidad de contaminantes (etanol y metales pesados) en el teleósteo de agua dulce Dario rerio (Hamilton, 1822) y los antípodos marinos, Gammarus aequicauda (Martynov, 1931) y Gammarus chevreuxi (Sexton, 1913)

Abstract

Esta tesis tiene como objetivo investigar los efectos del etanol y metales pesados (cadmio y mercurio) en los patrones diarios de dos especies acuáticas clave: pez cebra (Darío rerio) y anfípodo gammarus (G. aequicauda y G. chevreuxi). La investigación se realizó en dos niveles organizativos: comportamental y molecular. Con este fin, hemos establecido cuatro objetivos específicos: 1. Investigar los efectos al etanol en el pez cebra en función en su ritmo circadiano. 2. Determinar la existencia de un ritmo diario de la toxicidad del cadmio en el pez cebra. 3. Caracterizar en Gammarus chevreuxi los efectos en la actividad locomotora debido a sedimentos contaminados con mercurio. 4. Evaluar la calidad ambiental de los sedimentos de la cuenca sur del Mar Menor influenciados por históricas actividades mineras. Por lo tanto, estos nuevos datos tiene la intención de señalar la importancia de aplicar un enfoque multidisciplinario para estudios toxicológicos, así como elevar la importancia de la elección del momento adecuado para realizar el ensayo de toxicidad Metodología Los experimentos llevados a cabo en la presente investigación siguieron la legislación española sobre protección de animales y prácticas de laboratorio y fue aprobado tanto por el Comité Nacional de Protección de los Animales y el Comité de Bioética de la Universidad de Murcia - Los muestreo de crustáceos se realizaron en las zonas próximas a la costa mediante el uso de redes de 5 µ de luz de maya. Y su trasporte con aireación y refrigeración . Los muestreos de pez cebra se realizaron en las cámaras del departamento de Fisiología animal.. - El etanol se adquirió a través de distribuidores comerciales y los sedimentos tóxicos directamente de las zonas de estudio mediante muestreos con barca. La extracción de los sedimentos se realizó utilizando cores y draga. Se almacenaran en refrigeradores a una temperatura de 4ºC. - Los test de mortalidad y comportamiento se realizaran en cámaras herméticas donde se permite el control de las condiciones de fotoperiodo y temperatura. - Las condiciones del agua antes y después de las exposiciones se medió con electrodos de pH y Oxígeno. - Lo análisis de la actividad ante exposiciones subletales se realizaron en las mismas cámaras y mediante la utilización de equipos de filmación sensibles a las luces infrarrojas, permitiendo así mantener las condiciones de oscuridad en los experimento que sea necesarios. - Determinación de metales pesados en tejidos, utilizamos La Espectroscopia de Emisión en Plasma Acoplado Inductivamente (ICP-AES) con Potencia RF: 1200W, Velocidad de bomba: 30r.p.m., Flujo de gas aux.:0.5l/min, Flujo de gas de nebulización: 0.5 l/min, Flujo de gas de refrigeración: 14 l/min, Flujo de gas de purga: Normal. - Para el estudio de expresión de diferentes genes realizamos la técnica de PCR cuantitativa utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un aparato ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Conclusiones 1. La exposición de pez cebra mediante baño a etanol a diferentes horas del día muestra un ritmo de toxicidad que refleja una mayor tasa de mortalidad en larvas durante el día comparado con los efectos durante la noche. Así mismo en adultos de pez cebra se observan efectos en su actividad natatoria y posición en la columna de agua siendo significativamente más severos durante la fase de luz. 2. La exposición de pez cebra mediante baño a cadmio durante diferentes horas del día reflejó un incremento de la mortalidad y acumulación del cadmio en tejidos durante la mitad de la fase de luz, así como una mayor reducción de la actividad locomotora cuando el pez es expuesto a concentraciones subletales, además la expresión de mt1 muestra un pico antes al final de la fase de luz. Todos estos resultados indican que el pez cebra es más vulnerable al cadmio durante la fase de luz que en la fase de oscuridad. 3. La exposición de Gammarus chevreuxi mediante sedimentos contaminados con mercurio mostró un efecto deletéreo en la actividad natatoria incluso en concentraciones consideradas no letales. Dichos efectos fueron más acusados durante el la fase de luz, que corresponde con la más activa del animal. 4. Nuestros resultados sugieren que la actividad locomotora y el número de surfacings se presentan cono una señal temprana de la interacción de los factores co-estresantes temperatura y sedimentos contaminados. Los parámetros comportamentales estudiados en Gammarus. aequicauda y Gammarus. chevreuxi tienen una conexión clara con la supervivencia de los organismos y pueden tener una relevancia ecológica. This thesis aims at investigating the effects of Ethanol and heavy metals (cadmium and mercury) on the daily patterns of two key aquatic species: zebrafish (Dario rerio) and amphipod gammarus (G. aequicauda and G. chevreuxi). The research was conducted in two organizative levels: Physiology behavior and molecular. With this purpose we have established four particular objectives: 1. To investigate time-dependent effects of ethanol exposure in zebrafish. 2. To determine the existence of a daily rhythm of cadmium toxicity in zebrafish. 3. To characterise the effects of locomotor activity to mercury-contaminated sediments in Gammarus chevreuxi. 4. To evaluate the environmental quality of the soft-bottoms from the southern basin of the Mar Menor lagoon influenced by historical mining activities. Hence, this new data intends to point out the importance of applying a multidisciplinary approach to toxicology studies, and also raise the importance of the time experimental setting of toxicity test. Methodology The experiments performed in the present research followed Spanish legislation on Animal Welfare and Laboratory Practices and was approved by both the National Committee on Animal Welfare and the Bioethics Committee of the University of Murcia. - The sampling of gammarids were conducted in the nearshore areas by using mesh of 5 μ. Their transportation was with aeration and cooling. The zebrafish samplings were performed in Animal Physiology's chambers of the department. - Ethanol was purchased by authorized distributors, and toxic sediments were extracted directly from the study areas by boat sampling. Sediments extraction was with cores and dredge. They were stored in the refrigerator at 4 ° C. - The test of mortality and behavior was conducted in chambers where control of the photoperiod and temperature conditions allowed. - Water conditions before and after exposure was measured with pH electrodes and oxygen. - The analysis of activity at sublethal exposures were conducted in the same chamber and using equipment sensitive to infrared light filming, thereby maintaining the conditions of darkness in the experiment is necessary. - Determination of heavy metals in tissues, we used emission spectroscopy Inductively Coupled Plasma (ICP-AES) RF Power: 1200W, pump speed: 30r.pm, aux gas flow: 0.5l / min gas flow. Misting: 0.5 l / min, the cooling gas flow: 14 l / min, purge gas flow: Normal. - Real-time PCR was performed using SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) and an ABI Prism 7500 apparatus (Applied Biosystems, Foster City, CA). Conclusions 1. Exposure of zebrafish using ethanol bath at different times of day shows a rate of toxicity reflecting a higher rate of mortality in larvae during the day compared to the effects overnight. Also effects in adult zebrafish are observed in their swim and activity position in the water column to be significantly more severe during the light phase. 2. Exposure zebrafish using cadmium bath during different times of day reflected an increase in mortality and cadmium accumulation in tissues during half of the light phase and a further reduction of locomotor activity when the fish is exposed to sublethal concentrations. Expression of mt1 shows a peak before the end of the light phase. All these results indicate that zebrafish are more vulnerable to cadmium during the light in the dark phase. 3. The exposure of Gammarus chevreuxi by mercury-contaminated sediments showed a deleterious effect on the swimming activity even considered non-lethal concentrations. These effects were most pronounced during the light phase, which corresponds to the most active animal. 4. Our results suggest that the locomotor activity and the number of surfacings an early sign of the interaction of co-temperature stressors and contaminated sediments occur cone. The behavioral parameters studied in Gammarus. aequicauda and Gammarus. chevreuxi have a clear connection to the survival of organisms and can have an environmental relevance.