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Title: Caracterizació molecular y funcional de Gbp4 de pez cebra : un nuevo componente del inflamasoma= Molecular and functional chraterization of zebrafish Gbp4: a new inflammasome component
Issue Date: 8-Sep-2015
Date of creation: 27-Jul-2015
Related subjects: 577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
59 - Zoología
612 - Fisiología
Keywords: Infección
Sistema inmunitario
Proteínas
Teleósteos
Biología molecular
Enfermedades
Enfermedades
Abstract: INTRODUCCIÓN: La señalización a través de los NOD-like receptors (NLRs), que son una familia de receptores citosólicos de reconocimiento de patrones (PRRs), da lugar al procesamiento y activación de las citoquinas pro-inflamatorias IL-1 β e IL-18 mediados por caspasa-1, así como de la inducción de una forma de muerte celular recientemente descrita llamada piroptosis. Para ello, los NLRs median la formación de plataformas multiproteicas de señalización llamadas inflamasomas, que alertan al sistema inmune de la presencia de infección o daño tisular. OBJETIVOS: (1) Establecimiento de un modelo de infección de Salmonella Typhimurium en pez cebra para estudiar la activación, el ensamblaje y el funcionamiento del inflamasoma; (2) Caracterización del papel de la flagelina de S. Typhimurium en el mecanismo de infección en pez cebra; (3) Caracterización del papel de Gbp4 de pez cebra en la activación y ensamblaje del inflamasoma, así como en la eliminación de S. Typhimurium; (4) Caracterización del papel de los neutrófilos en la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 en pez cebra; (5) Caracterización del papel de Gbp4 en la producción de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, y del de las prostaglandinas en la eliminación de S. Typhimurium. METODOLOGÍA: Los métodos utilizados en la tesis doctoral son: Ensayos de infección con S. Typhimurium, ensayos de actividad caspasa-1, toma de imágenes de larvas de pez cebra, reclutamiento de neutrófilos y análisis de la muerte celular, ensayos de luminescencia, citometría de flujo, análisis de expresión génica, Western blot, ensayo de reconstitución del inflamasoma en células HEK293. RESULTADOS: Aquí demostramos que la proteína Gbp4 de pez cebra, una enzima GTPasa inducible por IFNγ que alberga un dominio C-terminal CARD, se expresa en los neutrófilos y es necesaria para la eliminación de Salmonella Typhimurium in vivo dependiente del inflamasoma. A pesar de la presencia del dominio CARD, Gbp4 requiere la presencia de la proteína adaptadora Asc para desempeñar su función antibacteriana. Además, la actividad GTPasa de Gbp4 es indispensable para la activación del inflamasoma, el reclutamiento de neutrófilos al lugar de la infección, y la eliminación de S. Typhimurium. La reconstitución de los complejos Gbp4-Asc en células embrionarias humanas de riñón (HEK293) en cultivo, nos mostró que forman complejos macromoleculares con un anillo exterior de Asc y un núcleo de Gbp4. Mecanísticamente, Gbp4 es esencial para la liberación de prostaglandinas dependiente del inflamasoma, de las cuales PGD2 se asocia con la eliminación de bacterias mediada por Gbp4. Por tanto, nuestros resultados señalan a las proteínas de unión con GTPasa como los adaptadores clave del inflamasoma necesarios para la biosíntesis de prostaglandinas y la eliminación de bacterias intracelulares por los neutrófilos in vivo. CONCLUSIONES: (1) El pez cebra es un excelente modelo para estudiar la activación y la función del inflamasoma en respuesta a una infección por S. Typhimurium; (2) El reconocimiento intracelular de S. Typhimurium en pez cebra depende altamente de la producción de flagelina; (3) La activación del inflamasoma dependiente de Gbp4 mejora la resistencia de las larvas de pez cebra e incrementa la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium; (4) Tanto Gbp4 mutante que carece de la actividad GTPasa, como el doble mutante al que también le falta el dominio CARD, se comportan como dominantes negativos, incrementando la susceptibilidad a S. Typhimurium y, en paralelo, reduciendo la actividad caspasa-1; (5) El mutante de Gbp4 sin el dominio CARD actúa, al igual que GBP5 de mamíferos, rescatando la elevada susceptibilidad de las larvas deficientes en Gbp4, pero no aumenta la actividad caspasa-1 después de la infección con S. Typhimurium en pez cebra; (6) Gbp4 regula el reclutamiento de neutrófilos al lugar de infección y, además, la eliminación de S. Typhimurium dependiente de Gbp4 esta mediada por los neutrófilos; (7) El inflamasoma dependiente de Gbp4 activa la biosíntesis de las prostaglandinas, que a su vez fomentan la eliminación de S. Typhimurium. INTRODUCTION: The nucleotide-binding domain leucine-rich repeats (NLRs) constitute a family of cytosolic pattern recognition receptors (PRRs), which are the responsible for the caspase-1-mediated processing and activation of pro-inflammatory cytokines, such us IL-1 β and IL-18, and the induction of a recently described form of cell death called pyroptosis. NLRs achieve these functions by forming multiprotein signaling platforms, called inflammasomes, which alert the immune system about the presence of infection or tissue damage. OBJECTIVES: Taking that into consideration, the objectives of the present work are: (1) Establishment of a zebrafish – Salmonella Typhimurium infection model to study inflammasome activation, assembly and function; (2) Characterization of the role of flagellin of S. Typhimurium in the infection mechanism in zebrafish; (3) Characterization of the role of zebrafish Gbp4 in inflammasome activation, assembly and clearance of S. Typhimurium; (4) Characterization of the role of neutrophils in the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium in zebrafish; (5) Characterization of the role played by the Gbp4 inflammasome in prostaglandin production and S. Typhimurium clearance. METHODOLOGY: The following methods were used in this doctoral thesis: yolk sac or ear infection assays with S. Typhimurium, caspase-1 activity assays of infected larvae, counting of neutrophils using different zebrafish transgenic lines with fluorescent neutrophils using live imaging, neutrophil recruitment assays, cell death analysis, luminescence assays for the measurement of Il1-β contents, flow cytometry and FACS-sorting of fluorescent cells, gene expression analysis, western blot, inflammasome reconstitution assays in HEK293 cells. RESULTS: Here we report that zebrafish Gbp4, an IFNγ-inducible GTPase harboring a C-terminal CARD domain, is expressed in neutrophils and is required for the inflammasome-dependent clearance of Salmonella Typhimurium in vivo. Despite the presence of the CARD domain, Gbp4 requires the universal inflammasome adaptor protein Asc for mediating its antibacterial function. In addition, the GTPase activity of Gbp4 is indispensable for the inflammasome activation, the neutrophil recruitment and the clearance of S. Typhimurium. Reconstitution of Gbp4-Asc complexes in human embryonic kidney cells (HEK293) revealed a macromolecular complex with an outer ring of Asc and an core of Gbp4. Mechanistically, Gbp4 is essential for the inflammasome-dependent release of prostaglandins, of which PGD2 is associated with the Gbp4-mediated bacterial clearance. Our results, therefore, point to GTPase-binding proteins as the key inflammasome adaptors required for prostaglandin biosynthesis and intracellular bacterial clearance by neutrophils in vivo. CONCLUSIONS: The above results suggest that: (1) Zebrafish is an excellent model to study inflammasome activation and function upon S. Typhimurium infection; (2) Intracellular recognition of S. Typhimurium in zebrafish highly depends on flagellin production; (3) Gbp4-dependent inflammasome activation improves zebrafish larvae resistance and increases caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection; (4) A Gbp4 mutant lacking GTPase activity, as well as a double GTPase and CARD mutant, behave as dominant negatives by increasing the susceptibility to S. Typhimurium and, in parallel, decreasing caspase-1 activity; (5) A Gbp4 mutant lacking the CARD domain acts as mammalian GBP5; that is, rescues the higher susceptibility of Gbp4-deficient larvae but fails to increase caspase-1 activity upon S. Typhimurium infection in zebrafish; (6) Gbp4 regulates neutrophil recruitment to the site of the infection. In addition, the Gbp4-dependent clearance of S. Typhimurium is mediated by neutrophils; (7) The Gbp4-dependent inflammasome activates prostaglandin biosynthesis, which in turn promotes S. Typhimurium clearance.
Primary author: Tyrkalska, Sylwia Dominika
Director: Mulero Méndez, Victoriano Francisco
Faculty / Departments / Services: Escuela Internacional de Doctorado
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/45950
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 263
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
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