Identifying components of the non-Canonical RNA silencing mechanism in Mucor circinelloides = Identificación de componentes del mecanismo no canónico de silenciamiento mediado por RNA en Mucor circinelloides

Abstract

Introducción: El conocimiento cada vez mayor sobre la relevancia funcional de los pequeños RNAs endógenos (esRNAs) como riboreguladores ha estimulado la identificación y caracterización de estas moléculas en numerosos eucariotas. En el hongo basal Mucor circinelloides, un patógeno oportunista humano, se han descrito esRNAs que regulan la expresión de muchos genes que codifican proteínas. En la biogénesis de estos esRNAs participan una RNasa III denominada Dicer, una proteína Argonauta y dos RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRP). Además de participar en esta ruta canónica de silenciamiento mediado por RNA, los genes rdrp de M. circinelloides están implicados en la producción de una nueva clase de esRNA, que son independientes de Dicer. Estos esRNAs muestran un sesgo muy fuerte en la polaridad de las cadenas y una distribución aleatoria de tamaños, lo que sugiere que son productos de degradación de RNAm endógenos. El objetivo global de esta tesis es caracterizar esta posible ruta de degradación de RNAm, identificar la RNasa implicada y utilizar los mecanismos de silenciamiento de Mucor para realizar un análisis funcional a escala genómica. Estos objetivos globales se concretan en los siguientes: Objetivos: i) Análisis de la función de la ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRp en la regulación de la expresión génica. ii) Identificación in silico de RNasas de M. circinelloides candidatas a participar en la ruta de degradación independiente de Dicer. iii) Análisis del papel de los genes candidatos en la producción de esRNAs independientes de Dicer y dependientes de RdRP. iv) Construcción de genotecas genómicas para el análisis funcional de genes mediante RNA de interferencia (RNAi), utilizando vectores de silenciamiento para identificar secuencias de M. circinelloides con un posible papel en patogénesis. v) Generación de mutantes nulos de los genes candidatos para confirmar el fenotipo e investigar su papel en la patogénesis de Mucor. Métodos: El análisis de la función génica se llevó a cabo mediante manipulaciones genéticas in vitro e in vivo. Estas incluyen métodos para aislar, amplificar y analizar la expresión de genes específicos y para la transformación genética de células vivas. Se construyeron genotecas de DNA genómico en vectores de silenciamiento con promotores duales para el análisis funcional del genoma y la identificación de genes candidatos con un posible papel en la patogénesis de Mucor. Se utilizaron análisis fenotípicos para evaluar las funciones de los genes candidatos en el crecimiento, la morfogénesis y la virulencia de este hongo. Resultados: Los análisis de expresión demostraron que la nueva ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRP regula la expresión génica mediante la degradación específica de RNAm por una RNasa previamente desconocida. Esta ruta regula principalmente genes conservados implicados en metabolismo y procesos de señalización celular, tales como los requeridos para la biosíntesis del grupo hemo, y controla las respuestas a señales ambientales específicas. La búsqueda en el genoma de Mucor identificó varias RNasas candidatas, y el análisis funcional de los mutantes nulos correspondientes permitió identificar una nueva proteína, R3B2, que es específica de hongos basales. Esta RNasa III participa tanto en la ruta no canónica de degradación independiente de Dicer, como en la ruta canónica de silenciamiento dependiente de Dicer, lo que pone de manifiesto su papel crucial en la biogénesis y función de los esRNAs reguladores. Se ha utilizado el mecanismo canónico de silenciamiento para llevar a cabo el análisis funcional a escala genómica en Mucor, para lo cual se construyeron dos genotecas genómicas basadas en RNAi. La introducción de estas genotecas en M. circinelloides permitió identificar varios transformantes con fenotipos anormales. Los análisis moleculares y de silenciamiento demostraron que dos genes específicos fueron los responsables de las alteraciones fenotípicas estudiadas. El análisis fenotípico de los mutantes nulos correspondientes confirmó el papel de dichos genes en la morfogénesis y patogénesis de M. circinelloides. Conclusiones: Se ha identificado y caracterizado una nueva ruta no canónica de silenciamiento, independiente de Dicer y dependiente de RdRP, que regula la expresión génica mediante la degradación de RNAm específicos. La RNasa implicada en esta ruta, denominada R3B2, presenta una arquitectura de dominios única, es específica de hongos basales y también está implicada en el mecanismo canónico de RNAi. Estos resultados asignan un nuevo papel para las proteínas RdRP en un proceso de degradación de RNA que podría representar el primer paso en la evolución del RNAi. Se ha desarrollado con éxito un procedimiento para realizar análisis funcional a gran escala utilizando RNAi, lo que ha permitido identificar dos genes que participan en la morfogénesis de Mucor. El gen mcmyo5 codifica una miosina de clase V que juega un papel esencial en la morfogénesis y la patogénesis de Mucor. El gen mcclasp codifica una proteína CLASP, que también participa en la morfogénesis, pero no juega ningún papel importante en la patogénesis de Mucor. SUMMARY Introduction: The increasing knowledge on the functional relevance of endogenous small RNAs (esRNAs) as riboregulators has stimulated the identification and characterization of these molecules in numerous eukaryotes. In the basal fungus Mucor circinelloides, an emerging opportunistic human pathogen, esRNAs that regulate the expression of many protein coding genes have been described. These esRNAs share common machinery for their biogenesis consisting of an RNase III endonuclease Dicer, a single Argonaute protein and two RNA-dependent RNA polymerases. Besides participating in this canonical dicer-dependent RNA interference (RNAi) pathway, the M. circinelloides rdrp genes are involved in the production of a novel dicer-independent esRNA class, which showed a very strong strand bias, being exclusively sense to the mRNAs, and a random spread of size distribution, suggesting that they are degradation products of endogenous mRNAs. The overall objective of this thesis is to characterize this putative mRNA degradation pathway, identify the RNase involved and use the Mucor silencing mechanisms for whole-genome functional analysis. These global objectives are specified in the following: Objectives: i) Functional analysis of the rdrp-dependent dicer-independent pathway in the regulation of gene expression. ii) In silico identification of M. circinelloides candidate RNases to be involved in the dicer-independent degradation pathway. iii) Functional studies of the candidate genes in the production of rdrp-dependent dicer-independent esRNAs. iv) Construction of genomic libraries for functional analysis by knocking-down genes using silencing vectors to identify M. circinelloides sequences with putative roles in pathogenesis. v) Generation of null mutants for each candidate gene to confirm the phenotype and investigate their roles in Mucor pathogenesis. Methods: in vivo and in vitro genetic manipulations were used to analyze gene functions. These include methods to isolate, amplify and analyze the expression of specific genes and genetic transformation of living cells. Genomic DNA libraries were constructed in silencing vectors containing dual promoters for whole-genome functional analysis and identification of candidate genes with a possible role in Mucor pathogenesis. Phenotypic analyses were used to evaluate the functions of candidate genes in growth, morphogenesis and virulence of this fungus. Results: Expression analysis demonstrated that the new rdrp-dependent dicer-independent pathway regulates gene expression by promoting the specific degradation of mRNAs by a previously unknown RNase. This pathway mainly regulates conserved genes involved in metabolism and cellular processes and signaling, such as those required for heme biosynthesis, and controls responses to specific environmental signals. Searching the Mucor genome for candidate RNases to participate in this pathway, and functional analysis of the corresponding knockout mutants identified a new protein, R3B2, which is only found in basal fungi. This RNase III-like protein participates in both the rdrp-dependent dicer-independent non-canonical pathway and the canonical dicer-dependent RNAi pathway, highlighting its crucial role in the biogenesis and function of regulatory esRNAs. RNAi was applied to carry out whole-genome functional analysis in Mucor. Two RNAi-based genomic libraries were constructed. Introduction of these libraries into M. circinelloides identified several transformants with abnormal phenotypes. Silencing and molecular analyses demonstrated that two specific genes were responsible for the phenotypic alterations. Phenotypic analyses of the corresponding disruption mutants revealed the role of those genes in M. circinelloides morphogenesis and pathogenesis. Conclusions: A novel non-canonical RNA silencing mechanism promoting mRNA degradation in M. circinelloides has been identified and characterized. This pathway is rdrp-dependent dicer-independent and regulates gene expression by degrading specific mRNAs. The RNase involved in this pathway, R3B2, presents unique domain architecture and it is also involved in the canonical dicer-dependent RNAi pathway. Our results expand the role of RdRPs in gene silencing and reveal the involvement of these proteins in a new RNA degradation process that could represent the first step in the evolution of RNAi. A new approach for large-scale functional genomics using RNAi has been successful developed in M. circinelloides. Two genes that participate in Mucor morphogenesis have been identified. Gene mcmyo5 encodes a Myosin class V protein that plays an essential role in Mucor morphogenesis and pathogenesis. Gene mcclasp encodes a CLASP protein, which is also involved in morphogenesis, but does not play any significant role in Mucor pathogenesis.