Patología cervical : valor predictivo de la técnica inmunocitoquímica p16/ki67 para detectar lesión CIN2+ subyacente

Abstract

El carcinoma de cérvix representa la tercera neoplasia más frecuente en el mundo en las mujeres y una de las causas principales de muerte en países en vías de desarrollo. El virus del papiloma humano (VPH) es causa necesaria pero no suficiente para el desarrollo de esta neoplasia, puesto que casi todos los casos diagnosticados (99%) resultan positivos. Está totalmente asumido que el screening periódico con el test de Papanicolau es efectivo en reducir la incidencia y mortalidad del cáncer cervical, aunque en ocasiones puede presentar baja sensibilidad. La determinación de VPH-AR aporta baja especificidad, dado que la mayoría de infecciones por VPH son transitorias (hasta un 90% de las infecciones se aclaran en los dos primeros años). Nuestro estudio versará de cómo un marcador dual inmunocitoquímico (p16/ki67) puede indicar la desregulación del ciclo celular causado por oncoproteínas del VPH: E6 y E7. OBJETIVOS: El objetivo principal de esta tesis es: o Comprobar si la tinción dual con biomarcadores p16INK4a y Ki-67 que se expresan en las células de las citologías diagnosticadas de ASC y LSIL se asocia bien con lesión CIN2+ subyacente, o con progresión en un período determinado a CIN2+ Y los objetivos secundarios: o Comparar la tasa de positividad, sensibilidad y especificidad para citología con tinción dual versus determinaciónVPH-AR, para detectar lesiones CIN2+ o Ver qué relación guarda la positividad de la técnica dual p16/ki-67 con los distintos genotipos virales de alto riesgo, en los casos confirmados histológicamente como CIN2+. Frecuencia de los distintos genotipos en estas lesiones

METODOLOGÍA GENERAL: • OBJETIVO PRINCIPAL: Se seleccionaron 306 pacientes a las que se les realizó técnica dual inmunocitoquímica p16/ki-67. Tras su realización se valoró como positiva o negativa. De las 306 muestras citológicas, el 50% de ellas se siguió de toma biópsica, con tres posibles diagnósticos: negativo para displasia (16), CIN1 (80) y CIN2+ (57). o El “gold standard” es el diagnóstico histológico de CIN2+ o El seguimiento de las pacientes fue de 1 día hasta 30 meses en algún caso • OBJETIVO Nº2: A 146 pacientes de las 306 se les realizó además tests de VPH: captura híbrida (HC2) y genotipado por PCR (Clart® HPV2). • OBJETIVO Nº3: De las 57 pacientes en las que se confirmaron histológicamente lesiones de CIN2+ se enviaron cortes de tejidos embebidos en parafina (TEP) a la unidad de virología para genotipado con PCR (método Clart®). RESULTADOS: OBJETIVO PRINCIPAL: o Se obtiene un aumento significativo de la sensibilidad para detectar lesión CIN2+ subyacente, manteniendo la alta especificidad que ya aportaba el test de papanicolau por sí solo. o Se observan leves diferencias en sensibilidad/especificidad entre los ASC y los LSIL OBJETIVO Nº 2: Se observa, tanto en ASC como en LSIL, una similar sensibilidad entre ambos tests (técnica dual y determinación de VPH) para detectar lesión CIN2+ subyacente cercana al 90%, existiendo sin embargo una especificidad mayor para la técnica dual, estadísticamente significativa. OBJETIVO Nº3: Se diagnosticó CIN2+ en 57 pacientes de las 306 incluídas en el estudio (18,6%). En más de la mitad de los casos (el 56%) la infección fue por un único genotipo, siendo el más frecuente el 16 (en 14 pacientes, el 50% de los casos positivos para VPH-AR), seguido del 31, y después con la misma frecuencia el 18, 45, 51 y 58. En los casos de infección múltiple también es el genotipo 16 el que más frecuentemente se asocia con otros genotipos (hasta en un 59% de los casos). El VPH 18 sólo aparece asociado en un 18% con otros genotipos. La frecuencia absoluta ha sido para el VPH16, seguido del 31 y posteriormente del 18.

SUMMARY Cervical cancer is the third most common neoplasia in women and still is one of the main causes of death in less developed countries. Human papillomavirus (HPV) is necessary but not sufficient cause for this neoplasia as almost all the diagnosed cases (99%) were positive for cervical cancer. Regular screening together with the performance of a Pap test are believed to be effective in lowering cervical cancer incidence and mortality rates, although it can show low sensitivity. HR-HPV tests have a low specificity as most HPV infections are temporary (up to 90% of the infections resolve within the first two years). Our study will deal with how immunocytochemistry involving dual staining for p16 and Ki-67 can show cell cycle deregulation caused by HPV oncoproteins: E7 inactivates pRb, so p16 overexpression increases dramatically, and E6 stimulates the proliferative activity of Ki-67 by interfering with p53. OBJECTIVES: The main objective of this thesis is to: o Check that dual staining of ASC and LSIL cytology with p16INK4a and Ki-67 biomarkers is associated with an underlying CIN2+ lesion, or is progressing to CIN2+ over a specific period of time. And the following secondary objectives: o Comparing positivity, sensitivity and specificity rates for positive, dual stained results for dual staining cytology to determination of HR-HPV, in order to detect CIN2+ lesions.

o Observing the connection of positive dual-stained results for p16 and Ki-67 with the different high-risk viral genotypes in histologically confirmed cases of CIN2+. Frequency with which different genotypes appear in these lesions. MATERIALS AND METHODS

• MAIN OBJECTIVE: 306 selected patients underwent p16/Ki-67 dual immunostaining testing. The tests were positive or negative. Out of the 306 cytology samples, 50% were followed by bioptic sampling (histological analysis of 153 patients), with three possible diagnoses: negative for dysplasia (16), CIN1 (80) and CIN2+ (57). o The gold standard is the histologic diagnosis of CIN2+. o The Clinical Follow-up of patients took from 1 day up to 30 months in some cases.

• OBJECTIVE No.2: 146 patients underwent HPV testing as well: Digene Hybrid Capture (HC 2) test and a PCR-based genotyping assay (Clart® HPV2). • OBJECTIVE No.3: Sections of paraffin-embedded tissues from the 57 patients were sent to the Department of Virology for a PCR-based genotyping assay (Clart® HPV2). RESULTS: MAIN OBJECTIVE: o Three hundred and forty-nine p16/Ki-67 dual-stained cytology tests were performed in 306 patients with ASC and LSIL diagnoses, resulting in a general and important rise in sensitivity for the detection of an underlying CIN2+ lesion, maintaining the same high specificity given only by the Pap test. o Some minor differences in sensitivity and specificity are found in ASC and LSIL. OBJECTIVE No. 2: In ASC and LSIL, both tests (dual staining and determination of HPV) have a similar sensitivity of 90% when detecting any underlying CIN2+ lesion, although a statistically significantly higher specificity of dual stained cytology has been observed. OBJECTIVE No. 3: CIN2+ has been diagnosed in 57 patients out of the 306 patients who participated in this study (18,6%). In more than half of the cases (56%), the infection was due to only one genotype, the most common being genotype 16 (in 14 patients or 50% of the HR-HPV-positive cases), followed by genotype 31 and then genotypes 18, 45, 51 and 58 with the same frequency. In cases of multiple infection, it is also genotype 16 which is most frequently associated with other genotypes (in up to 59% of the cases). HPV-18 is only associated with other genotypes in 18% of the cases. In order, the following absolute frequency was observed: HPV-16, 31 and finally 18.