Estudio sobre la seguridad del constructo de células mesenquimales, fosfato tricálcico y matriz ósea desmineralizada para uso clínico

Abstract

Objetivo: Comprobar la seguridad y valorar la eficacia del uso del constructo formado por células mesenquimales de médula ósea humana (MSC) sembradas y cultivadas sobre matriz po-rosa de fosfato tricálcico (FTC) asociadas a matriz ósea desmineralizada (MOD) implantada en en ratones inmunodeprimidos NOD/SCID. Objetivos específicos: Estudiar la toxicidad aguda y crónica del implante (FTC+MSC+MOD) en modelo murino NOD/SCID. Estudiar la biodistribución del constructo (FTC+MSC+MOD) implantado en modelo murino NOD/SCID. Valorar si hay formación de tejido óseo en el lugar del implante en el ratón NOD/SCID del constructo (FTC+MSC+MOD). Valorar a partir de que momento se observa formación ósea en el lugar del implante en el ratón NOD/SCID del constructo (FTC+MSC+MOD).

Metodología: Estudio prospectivo analítico con 30 ratones NOD/SCID divididos en 2 grupos de ensayo. El grupo experimental, de 25 ratones, se implanta subcutánea e intramuscularmente un constructo formado por células madre mesenquimales humanas sembradas en fosfato tricálcico mezcladas con matriz ósea desmineralizada (MSC+FTC+MOD). En el segundo grupo, control, de 5 ratones se implanta de forma análoga el constructo formado por suero salino fisiológico al 0,9%, fosfato tricálcico y matriz ósea desmineralizada (SSF 0,9%+FTC+MOD). Los ratones del primer grupo fueron sacrificados por parejas de macho y hembra a las 24h, a las 48h, a la semana, a las 2, 5, 7 y 9 semanas tras la cirugía. Los ratones del se-gundo grupo y los 11 ratones restantes del primer grupo se sacrificaron a las 12 semanas. Se ha evaluado la toxicidad aguda, a las 24 y 48 horas tras la cirugía, mediante el control del peso, el índice de bienestar animal, análisis sanguíneo, bioquímico y estudios histológicos de los órganos: hígado, pulmón, bazo, cerebro, riñón, corazón, gónadas, médula ósea y hueso. La toxicidad crónica fue evaluada mediante los mismos estudios que en fase aguda sacrificando 2 ratones en la 1ª, 2ª, 5ª, 7ª, 9ª semana, once ratones en la 12ª semana y los 5 ratones del 2º grupo. Para evaluar la biodistribución del constructo se realizó análisis PCR-RT de 2 proteínas, la Actina y la β2microglobulina a hígado, pulmón, bazo, cerebro, riñón, corazón, gónadas, médula ósea y de la sangre periférica de cada ratón sacrificado. Para valorar la eficacia se realizaron estudios histológicos del constructo implantado con hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson y estudios inmunohistoquímicos cualitativos y cuantitativos con anticuerpos anti-osteocalcina.

Resultados o Conclusiones El implante subcutáneo o intramuscular del constructo FTC+MSC+MOD no ha mostrado signos de toxicidad aguda o crónica en el modelo murino NOD/SCID. Tras la implantación del constructo FTC+MSC+MOD implantado de forma subcutánea o intramuscular en el modelo murino NOD/SCID no han sido halladas células mesenquima-les humanas en ningún órgano. Permaneciendo las células en el lugar del implante. No se han observado diferencias estadísticamente significativas entre el poder osteogéni-co del constructo FTC+MSC+MOD. Aunque si existen entre el poder osteogénico del im-plante subcutáneo e intramuscular. La formación de tejido óseo estructurado se ha observado a partir de la semana 7 en la zona de implante subcutánea y a partir de la semana 9 en la zona de implante intramus-cular.

“Safety of the construct of mesenchymal cells, tricalcium phosphate and bone matrix de-mineralized for clinical use.”

SUMMARY (Objectives and methodology): Objectives To check the security and assess the effectiveness, of the use of mesenchymal cells of human bone marrow (MSC) seeded and cultured on tricalcium phosphate porous matrix (FTC) associated with demineralized bone matrix (MOD) implanted in immunosuppressed mice NOD/SCID. Specific objectives: To study the acute and chronic toxicity of the implant (FTC+MSC+MOD) construct in muri-ne NOD/SCID model. To study the biodistribution of the implant (FTC+MSC+MOD) construct in murine NOD/SCID model. To evaluate the formation of bone tissue at the site of the (FTC+MSC+MOD) construct im-plant. To evaluate the cronology of bone tissue formation at the site of the (FTC+MSC+MOD) construct implant.

Methodology Analytical prospective study with 30 NOD/SCID mice divided into 2 treatment groups was performed. In the first group of 25 mice, a construct of mesenchymal stem cells seeded and cultured on tricalcium phosphate porous matrix and associated with demineralized bone matrix (MSC+FTC+MOD) was implanted subcutaneously and intramuscularly In the second group of 5 mice, a construction of 0,9% saline, matrix porous tricalcium phosphate associated with demineralized bone matrix (SSF0,9%+FTC+MOD) was im-planted also subcutaneously and intramuscularly Male and female mice pairs of the first group were - sacrificed at 24 h, 48 h, 1 week and then 2,5,7 and 9 weeks after surgery. The second group of mice and the 11 remaining mice of the first group were sacrificed at 12 weeks. Acute toxicity was evaluated by the assessment of - weight, the animal welfare score, blood and biochemical analysis and histological studies of organs: liver, lung, spleen, brain, kidney, heart, gonads, bone marrow and bone of each mouse sacrificed in the first 48h after surgery. Chronic toxicity was evaluated by the same studies sacrificing 2 mice in the 1st, 2nd, 5th, 7th and 9th week, eleven mice in the 12 th week, and the remaining 5 of the second group. Biodistribution of the construct was analysed by RT-PCR test of 2 proteins, actin and the β2microglobulin of liver, lung, spleen, brain, kidney, heart, gonads, bone marrow and pe-ripheral blood from each mouse sacrificed. Effectiveness was evaluated at implanted site by qualitative and quantitative studies Im-munohistochemistry with anti-osteocalcin antibodies and histological studies with hema-toxylin-eosin, Masson's trichrome were performed.

Conclusions Construct (FTC+MSC+MOD) implanted via subcutaneous or intramuscular has not pre-sented any signs of acute or chronic toxicity in the mouse model NOD / SCID. Human mesenchymal stem cells have not been found in any organ analyzed at murine model of Construct (FTC+MSC+MOD) implanted subcutaneously or intramuscularly . These have remained at the implant site. No statistically significant differences were observed between the osteogenic power of the construct MSC + FTC + MOD. However, it has definetely been found between subcutane-ous and intramuscular implant. Structured bone formation is observed from week 7 in the subcutaneous implant and from week 9 in the intramuscular implant.