Estudio cinético de la fase de transición del mecanismo de MichaeliS'Menten con inhibición por exceso de sustrato.

Abstract

En la literatura científica, desde el año 1965, se han descrito más de 800 enzimas que sufren desviaciones de la cinética de Michaelis-Menten, basándose en estudios de estado estacionario '. Estos hechos han animado a distintos autores a intentar explicar los resultados experimentales bajo enfoques más rigurosos que los utilizados previamente -. encontrando que a diferencia de la ecuación clásica de Michaelis-Menten, que es de grado 1:1 con respecto al sustrato, podrían darse grados tales como 1:2; 2:2; 2:3; 3:4; etc. Estos descubrimientos cuestionan fuertemente si debe aceptarse que las enzimas son en su mayoría michaelianas, ya que si esto no es así. los parámetros clásicos tales como KM y Vma, perderían su significado físico para tales enzimas. Es conocida la existencia de posibles causas que pueden dar lugar a desviaciones de la cinética de Michaelis-Menten •*. Algunos ejemplos son: la enzima que contiene una impureza que reacciona con el sustrato, o bien la enzima que existe en dos formas con diferentes actividades o en la que se producen agregaciones o micelas '. Algunas de las desviaciones cinéticas encontradas podrían deberse a tales hechos. No obstante, una vez suprimidos tales efectos donde es posible, ios hechos experimentales indican que son muchas las enzimas que dan cinéticas anómalas, entre ellas se encuentran acetilcolinesterasa, fosfatasa acida, adenosín desaminasa, ariisulfatasa, bencilamina oxidasa. a-quimotripsina, fumarasa, p-galactosidasa, galactosa deshidrogenasa, peroxidasa y xantín oxidasa ~. Algunas posibles causas cinéticas para explicar estas desviaciones podrían ser: a) inhibición por sustrato, b) activación por sustrato, c) rutas al azar, d) efectos alostéricos. El grupo más numeroso de desviaciones de la cinética de Michelis-Menten corresponde a la inhibición por sustrato (352 ejemplos). En la mayoría de los casos en los que aparece este tipo de efecto, lo que se ha hecho es trabajar a bajas concentraciones de sustrato, de tal manera que se obtenga una ecuación de velocidad 1:1 con respecto al sustrato y así poder definir KM y V„„. No obstante, se han utilizado en algunos trabajos ^ concentraciones elevadas de sustrato de tal manera que se obtiene la ecuación de velocidad real para el mecanismo bajo estudio; la regresión no lineal permite calcular los parámetros globales que aparecen bajo estas condiciones en la ecuación de velocidad. Sin embargo, el cálculo de las constantes de velocidad implicadas en el mecanismo no puede llevarse a cabo con datos únicamente de estado estacionario. La posibilidad del uso de técnicas rápidas permite obtener información sobre la fase de transición del sistema y la elucidación completa del mecanismo puede llevarse a cabo mediante la utilización conjunta de ambas técnicas ". Bajo este enfoque abordamos el estudio cinético del mecanismo más simple de inhibición por sustrato: mecanismo de Michaelis-Menten con inhibición por sustrato o bien mecanismo Uni-Uni con inhibición por sustrato.