Comunicación materno-embrionaria y sus consecuencias en el desarrollo embrionario en bovino= Maternal-embryo interaction and consequences for embryo development in cattle

Abstract

El objetivo de esta tesis ha sido estudiar la comunicación materno-embrionaria y sus consecuencias en el desarrollo embrionario. Para ello, se emplearon novillas Holstein primíparas postparto secadas (n=10) u ordeñadas (n=11) y se recogieron muestras de sangre dos veces por semana desde 15 días antes del parto hasta 100 días después, para medir ácidos grasos no-esterificados, β-hidroxibutirato, glucosa, insulina y factor de crecimiento insulínico tipo 1. Alrededor del día 60 (d60) postparto, se transfirieron 65 embriones in vitro, entre 2-4 células, al oviducto ipsilateral al cuerpo lúteo (CL) a todas las vacas en el d2 del ciclo estral, para observar el desarrollo embrionario cinco días después. Pasado el d90 postparto, se transfirieron 15-20 blastocistos in vitro al útero en d7, recuperándose el d14 tras sacrificarlas. El peso y la condición corporal fueron diferentes entre los grupos durante el estudio. Las vacas lactantes presentaron unos niveles altos de ácidos grasos no-esterificados y β-hidroxibutirato y bajos de glucosa, insulina y factor de crecimiento insulínico tipo 1 comparados con las no lactantes. En las vacas lactantes se recuperaron menos embriones en estadio de blastocisto comparado con las no lactantes. Sin embargo, la supervivencia embrionaria y el tamaño del concepto el d14 fue igual entre ambos grupos. Como conclusión, el tracto reproductivo de las vacas lactantes tiene una menor capacidad para mantener el desarrollo embrionario temprano comparado con las no lactantes. A continuación, se sincronizaron novillas de carne y las que presentaron celo (Día 0) se dividieron en cíclicas (no inseminadas, n=6) o gestantes (inseminadas artificialmente, n=11). Después de sacrificarlas (d3), ambos oviductos se diseccionaron, dividiéndose en ámpula e istmo. Cada porción se lavó para confirmar la presencia del ovocito/embrión y se abrió para obtener las células oviductales, que se congelaron en nitrógeno líquido para realizar un microarray. Todos los ovocitos/embriones se localizaron en el istmo del oviducto ipsilateral. El microarray de las células reveló que el embrión no afecta el transcriptoma del oviducto. Sin embargo, existe una gran diferencia entre el ámpula y el istmo del oviducto ipsilateral en novillas gestantes. Así, 2287 genes se expresaron de forma diferente: 1132 estaban sobre-expresados y 1155 menos expresados en el istmo. El análisis ontológico mostró que algunos de los procesos biológicos más representados en el istmo eran: síntesis de nitrógeno, lípidos, nucleótidos, esteroides y colesterol, transporte mediado por vesículas, ciclo celular, apoptosis, endocitosis y exocitosis. En el ámpula fueron: movimiento celular, motilidad y migración, reparación de ADN, homeostasis del calcio, biosíntesis de carbohidratos y regulación del movimiento y frecuencia del batido ciliar. En resumen, pese a las grandes diferencias entre el transcriptoma de istmo y ámpula, los datos sugieren que el embrión no altera la expresión de las células del istmo, aunque no se puede descartar un efecto localizado en el lugar concreto donde estaba el embrión. Finalmente, se trataron novillas de carne sincronizadas (n=43) con una dosis de solución salina el d1 (control) o 3000UI los días 1, 2, 3, o 4 después del celo. La hCG en el d1 no tuvo efecto ni en el CL ni en la concentración de progesterona. Sin embargo, el tratamiento los días 2, 3, o 4 incrementó el CL desde el día 6-12, 9-11, y 9 y 10, respectivamente (P<0.05), acompañado por un incremento en la progesterona, desde el día 6-11 (hCG d2) y desde el día 8-13 (hCG d4) (P<0.05). En d4, la hCG indujo la formación de un CL accesorio en el 89% de las novillas. Para concluir, la administración de hCG el d2 después del celo conlleva un incremento de progesterona en la circulación desde el d6, que podría beneficiar la elongación del concepto. The objective of this thesis was to study embryo-maternal interaction and its consequences on embryo development. Post-calving primiparous Holstein heifers were dried off (n=10) or milked (n=11). Blood samples were taken twice per week from 15 d before calving to 100 d postpartum to measure nonesterified fatty acids, β-hydroxybutyrate, glucose, insulin and insulin-like growth factor-I. Around 60 d postpartum, approximately 65 two- to four-cell embryos, produced in vitro, were endoscopically transferred to the oviduct ipsilateral to the corpus luteum (CL) of all cows on Day 2 of the estrous cycle. Five days later, the oviduct and uterus were flushed and blastocysts were recorded. After 90 d postpartum, 15 to 20 in vitro-produced blastocysts were transferred to the uterus of each cow on Day 7 and recovered after slaughter on Day 14. Body weight and body condition score were significantly different between groups during the study. Nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate were higher and glucose, insulin and insulin-like growth factor-I were lower in lactating compared to nonlactating cows. Fewer embryos developed to the blastocyst stage on Day 7 in lactating compared with the nonlactating cows. However, embryo survival and conceptus size on Day 14 were not different between lactating and nonlactating cows. In conclusion, the reproductive tract of the lactating dairy cow is compromised in its ability to support early embryo development compared with nonlactating cows. Then, cross-bred beef heifers were synchronized and those in standing oestrus (=Day 0) were assigned to cyclic (non bred, n=6), or pregnant (artificially inseminated, n=11) groups. After slaughter on Day 3 both oviducts were isolated and divided in ampulla and isthmus. Each portion was flushed to confirm the presence of an oocyte/embryo and opened longitudinally to obtain epithelial cells. Cells were snap-frozen in liquid nitrogen for microarray analysis. All recovered oocytes/embryos were located in the isthmus of the ipsilateral oviduct. Microarray analysis of oviductal cells revealed that the presence of an embryo did not affect the oviduct transcriptome. However, major differences existed between the ampulla and isthmus of the oviduct ipsilateral to the CL. Thus, 2287 genes were differentially expressed (P<0.01) of which 1132 and 1155 were up- and down-regulated in the isthmus, respectively. Gene ontology revealed that some of the biological processes overrepresented in the isthmus were: synthesis of different compounds, vesicle-mediated transport, cell cycle, apoptosis, endocytosis and exocytosis; whereas cell motion, motility and migration, DNA repair, calcium ion homeostasis, carbohydrate biosynthetic process and regulation of cilium movement and beat frequency were overrepresented in the ampulla. In conclusion, while large differences in gene expression were observed between the isthmus and ampulla, data suggest that the presence of an embryo does not alter the transcriptome of the cells of the isthmus, although a local effect at the precise position of the embryo cannot be ruled out. Finally, synchronized cross-bred beef heifers (n=43) were administered with saline on Day 1 (control) or 3000 IU hCG on Day 1, 2, 3, or 4 after oestrus. hCG on Day 1 had no effect neither on CL area nor progesterone concentration. However, treatment on Day 2, 3 or 4 increased CL area from Day 6 to 12, 9 to 11, and on Day 9 and 10, respectively (P<0.05). This was accompanied by an increase in progesterone, from Day 6 to 11 (hCG Day 2) and from Day 8 to 13 (hCG Day 4) (P<0.05). Injection of hCG on Day 4 induced the formation of accessory CL in 89% of heifers. In conclusion, administration of hCG at Day 2 after oestrus results in increased progesterone in circulation from D6, which should have beneficial effect on conceptus elongation.