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Title: Caracterización de las células ganglionares de la retina melanopsínicas y estudio de la degeneración y neuroprotección de las células ganglionares de la retina en el roedor
Issue Date: 13-Mar-2014
Date of creation: 12-Feb-2014
Related subjects: 617 - Cirugía. Ortopedia. Oftalmología
59 - Zoología
Keywords: Enfermedades y defectos del ojo
Enfermedades de la retina
Lesiones y heridas del sistema nervioso
Roedores
Oftalmología
Abstract: Objetivos Caracterizar la población de células ganglionares de la retina melanopsínicas (CGRm) en la rata adulta en relación con la población total de células ganglionares de la retina (CGR) y analizar su distribución espacial en la retina. Caracterizar si el Brn3a es un buen marcador de las CGR en ratones albino (Swiss) y pigmentado (C57BL/6). Analizar la curva temporal de muerte de las CGR de ratón después de la sección del nervio óptico (SNO), y evaluar el efecto neuroprotector del factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) sobre estas neuronas. Investigar la respuesta de las células de microglía fagocítica en las retinas axotomizadas y en las contralaterales a la lesión. Material y métodos La caracterización de las CGRm se llevó a cabo en 16 ratas albinas adultas Sprague-Dawley (SD). Para saber si las CGRm envían sus axones a través del nervio óptico (NO), se aplicó Fluorogold (FG) en el muñón del NO. Para conocer la proporción de CGRm que proyectaban a los colículos superiores (CS), región retinorrecipiente a la que proyectan el 98,4% de las CGRs en la rata, se aplicó FG en ambos CS. para saber si las CGRm expresan Brn3a y cuantificar automáticamente y comparar el número y distribución espacial de ambas poblaciones, se realizó la inmunodetección doble de melanopsina y Brn3a en retinas de animales intactos. Se utilizaron 158 ratones adultos pigmentados C57BL/6 y 34 albinos Swiss. Una semana antes de la SNO (a 0,5 mm del disco óptico), las CGR se trazaron retrógradamente con metanosulfonato de hidroxistilbamidina (OHSt), un análogo del FG. Para caracterizar el Brn3a como marcador de las CGR y su curso temporal de muerte tras SNO, los animales fueron sacrificados a diferentes intervalos de supervivencia tras la SNO (2, 5, 7, 9, 14 o 21 días). Como control se usaron animales intactos. Las retinas se disecaron en montajes globales y se incubaron con anticuerpos contra Brn3a. En un segundo grupo de experimentos se evaluó el efecto de una inyección intravítrea de BDNF (2,5 µg) o vehículo (PBS) en la población de CGR y de la microglía fagocítica. A tiempos crecientes tras la cirugía (3, 5, 7 y 14 días) se disecaron las retinas a plano y se inmunodetectó el Brn3a (CGR) e Iba1 (células de la microglía). Las CGR-OHSt+ y Brn3a+ se cuantificaron y se analizó la distribución espacial de las CGR-Brn3a+ construyendo mapas de isodensidad celular. Además, se cuantificaron las células de microglía fagocítica marcadas transcelularmente con OHSt e inmunodetectadas con Iba1 y se analizó su distribución espacial mediante mapas de vecinos. El mismo análisis de las CGR y las células de microglía se realizó en las retinas contralaterales a la SNO. Resultados En las retinas de rata en las que las CGR habían sido marcadas con FG aplicado en el MNO, se observó que el 99,05% de las CGR que expresan melanopsina se marcaban también con FG, por lo que estas neuronas proyectan sus axones a través del NO. Un 90,62% de las CGRm se encontraban marcadas con FG aplicado en los CS, por lo que estas células emiten proyecciones retinotectales. Tan sólo un 0,20% de las CGRm expresan Brn3a. La población total de CGRm fue de 2.046±48, lo cual supone un 2,62% de la población de CGR de rata adulta. Los mapas de vecinos revelaban una mayor densidad de CGRm en la periferia de la retina, y más concretamente en la región superotemporal. Esta distribución es complementaria a la distribución de la población de general CGR. En la retina de ratón, el Brn3a se expresa únicamente en las CGR y su expresión no se afecta por la SNO. En la retina de ratón pigmentado C57BL/6 y albino Swiss, el Brn3a se expresa en un 85,5% y 92,6% de las CGR-OHSt+, respectivamente. En ambas estirpes de ratones, los mapas de isodensidad revelan que la distribución de las CGR-Brn3a+ es muy similar a las CGR-OHSt+. En ambas cepas de ratón, la pérdida de CGR después de la SNO comienza a ser significativa con ambos marcadores a los 3 días después de la SNO y disminuye significativamente hasta los 9 días postlesión, momento en el que sobrevive un 15% de la población original Los mapas de isodensidad muestran que la muerte de CGR inducida por la SNO es difusa. En los grupos tratados con BDNF, la muerte se retrasa hasta los 5 días después de la SNO y la supervivencia de CGR es, a todos los tiempos post-lesión, significativamente mayor que al tratar con vehículo. Los mapas de isodensidad muestran que el BDNF retrasa la muerte de las CGR por toda la retina, no únicamente en la zona de la inyección. Conforme aumenta el tiempo después de la SNO, aumenta el número de células de microglía fagocítica, tanto en los grupos tratados con BDNF como en los tratados con vehículo, pero el número es menor en las retinas tratadas con BDNF. Los mapas de vecinos revelan que las células de microglía fagocítica aparecen a los 3 días de manera homogénea por toda la retina y que, conforme aumenta el tiempo post-SNO, aumenta el número de células microgliales que se distribuyen con un gradiente de densidad decreciente del centro a la periferia de la retina. Finalmente, en las retinas contralaterales a la SNO, se observa un aumento significativo del número de células de microglía fagocítica en comparación con las retinas control, aumento que es igual en los grupos tratados con BDNF o con vehículo. Estas células aparecen a los 3 días después de la SNO y su número y distribución se mantiene estable hasta los 14 días post-SNO. En cuanto a la población de CGR en estas retinas contralaterales a la SNO, el número de CGR es significativamente menor a los 21 días después de la SNO comparado con retinas control. SUMMARY Objectives To characterize the total numbers and spatial distribution of melanopsin retinal ganglion cells (mRGC) in the adult rat retina, in relation with the total population of retinal ganglion cells (RGC). To characterize whether Brn3a is a good marker for RGC in two mouse strains, an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) one. To analyze the temporal loss of RGC after optic nerve transaction (ONT), to assess the neuroprotective effect of BDNF in axotomized RGCs. To investigate the response of phagocytic microglial cells after ONT in the injured and contralateral to the lesion retinas. Material and methods Two months old albino Sprague-Dawley (SD) rats (n=16) were used to characterize the mRGC population. To investigate whether all retinal neurons immunodetected with melanopsin sent their axons through the optic nerve (ON), FG was applied in the ON stump. To assess the proportion of mRGC that project their axons to the superioir colliculi (SCi), the retinotectal area where 98.4% of the RGC project their axons in the rat, FG was applied onto both SCi. To assess whether mRGC express Brn3a and to quantify and compare the numbers and spatial distribution of both populations, Brn3a and melanopsin were double immunodetected in retinas from intact animals For the study in mouse, two months old mice were used (n= 158 pigmented C57BL/6 mice, and n= 34 albino Swiss mice). RGC were traced one week before ONT (at 0.5 mm from the optic disk), or euthanasia with hydroxystilbamidine methanesulfonate (OHSt, a FG analogue). To characterize Brn3a as a RGC marker and analyze the temporal loss of RGC after ONT, animals were sacrificed at increasing intervals post-ONT (2, 5, 7, 9, 14 or 21 days). As control, retinas from naive animals were used. Retinas were dissected as flat-mounts and immunodetected for Brn3a. In a second experimental group, the effect of an intravitreal injection of BDNF (2,5 µg) or vehicle (PBS) on RGC and phagocytic microglia was investigated. At increasing times post-surgery, ( 3, 5, 7, and 14 days) retinas were dissected as flatmounts, and Brn3a (RGC) and Iba1 (microglial cells) were double immunodetected. OHSt+RGC and Brn3a+RGC were quantified and the spatial distribution of Brn3a+RGC was assessed by isodensity maps. Phagocytic microglial cells transcellularly labelled with OHSt and Iba1+ were also quantified and their spatial distribution analyzed with neighbour maps. The same analyses were carried out in the contralateral to the lesion retinas. Results In rat retinas traced with FG from the ON, 99.05%, of the RGC that express melanopsin (mRGC) were traced. Thus, mRGC send their axons through the ON. When the tracer was applied to both SCi, 90.6% of the mRGC were traced, thus, most of the mRGC project to them. Finally, Brn3a and melanopsin were doubly immunodetected to assess whether ipRGCs express this transcription factor, and we found that only 0.20% of them were Brn3a+. In flat-mounted retinas, the total number of mRGC was 2,047±309, which amounts to a 2.6% of the total population of RGC. Neighbour maps disclosed that mRGC are placed preferentially in the retinal periphery and that their density is higher in the supero-temporal quadrant. This distribution is complementary to the general RGC population. In mouse retinas, Brn3a is only expressed by RGC and its expression does not change after ONT. In flat-mounted retinas of pigmented C57BL/6 and albino Swiss mice, Brn3a is expressed in 85.5% and 92.6% of the OHSt+RGC, respectively. In both mouse strains, isodensity maps reveal a similar distribution of Brn3a+RGC and OHSt+RGC. In mouse, RGC loss after ONT is first significant 3 days after ONT with both markers, OHSt and Brn3a. From 3 to 9 days post-ONT, the number of RGC decreases significantly. At 9 days, only 15% of the total population is still alive. Isodensity maps reveal that ONT induces a diffuse loss of RGC in the whole retina. In the experimental groups treated with BDNF, RGC death is delayed until 5 days after ONT, and the survival of RGC was higher than in the vehicle-treated groups at all time post-ONT. Isondensity maps showed that BDNF delays RGC death across the whole retina and not only in the localized area of the injection. In both experimental groups, phagocytic microglial cells appeared at 3 days after ONT and the number of these cells increased as the time post-lesion increased, although this response was significantly attenuated by BDNF administration. At 3 days, phagocytic microglial cells were distributed homogenously across the retina. As the time post-lesion increased, their density was higher in the centre than in the periphery of the retina. Finally, in the contralateral to the lesion retinas, there was a significant increase of phagocytic microglial cells compared to control retinas and this increease was the same in the BDNF and vehicle treated groups. These cells appear at 3 days post ONT and their number and distribution is stable up to 14 days post-ONT. Concerning the RGC population in the contralateral retinas, their number significantly decreased at 21 days after ONT, compared to control retinas.
Primary author: Galindo Romero, Caridad
Director: Agudo Barriuso, Marta
Vidal Sanz, Manuel
Villegas Pérez, Mª Paz
Faculty / Departments / Services: Facultad de Medicina
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/38341
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 226
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
Appears in Collections:Ciencias de la Salud

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