Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10201/37827

Title: Activación por lípidos de proteínas quinasas C
Issue Date: 7-Feb-2014
Date of creation: 18-Dec-2013
Related subjects: 577 - Bioquímica. Biología molecular. Biofísica
Keywords: Proteínas
Enzimas
Lípidos
Abstract: 1. OBJETIVOS  Determinación de la función del dominio regulador C2 de la PKCα en la activación provocada por Ca2+, PtdSer y PIP2.  Caracterizar la interacción entre los dominios C1B de las PKC nuevas y fosfolípidos negativos, su especificidad y su dependencia de DOG y PtdOH.  Caracterizar los residuos aminoácidos involucrados en la interacción entre el dominio C1Bε y fosfolípidos negativos (PtdSer, PtdOH y cardiolipina). 2. METODOLOGÍA  Clonación de los dominios C1Bs de las isoenzimas de PKC nuevas (Ɵ, η, δ, ε) y clásica (γ) en vector de expresión de células de mamíferos (pECFP) para estudiar las interacciones lípido-proteína existentes entre ellos a diferentes concentraciones de fosfolípidos negativos, diacilglicerol y forbol-12-miristato acetato a través de la técnica de transferencia de energía por resonancia (FRET).  Purificación de la proteína PKCα silvestre y del mutante del clúster rico en lisinas de esa misma isoenzima utilizando el sistema de expresión de baculovirus para la realización de ensayos de actividad quinasa en presencia de fosfato radiactivo (ATP-32γ) a diferentes concentraciones de calcio, diacilglicerol, fosfatidilserina y PIP2. 3. RESULTADOS DE LA TESIS DOCTORAL 3.1. El phosphatidilinositol 4,5-Bifosfato disminuye la concentración de Ca2+, fosfatidilserina y diacilglricerol requerida para la activación de la PKCα. Los resultados obtenidos en este trabajo son compatibles con el mecanismo secuencial previamente propuesto en nuestro grupo y posteriormente confirmado in vivo. Básicamente, el incremento intracelular en la concentración de Ca2+ es el desencadenante de la translocación de la PKCα a la membrana plasmática. Una vez se llega a este punto, se pueden presentar dos situaciones: en microdominios enriquicidos únicamente con fosfatidilserina, el docking del dominio C2 no es suficiente para liberar el el dominio catalítico del sitio de unión a substrato, como ha sido visto en la estructura 3D recientemente resuelta, el dominio C1B permanecería bloqueando el dominio catalítico. Por todo ello, la presencia de diacilglicerol en las vesículas permite el acoplamiento de al menos el dominio C1A, permitiendo a la enzima su total activación. Una segunda situación puede ser dada cuando los microdominios están enriquecidos con fosfatidilserina y PIP2 en la membrana plasmática. En este caso el dominio C2 se acopla con una diferente orientación ya que se ancla en dos diferentes puntos: Ca2+/PS y PIP2, lo que podría inducir a un cambio conformacional que libera el dominio C1 de la conformación de bloqueo y permite que el substrato tenga acceso al sitio catalítico de la enzima, con la consecuente activación completa de la enzima. 3.2. Los dominios C1B de las PKC nuevos ε Y η tienen una mayor afinidad de unión a membranas que las PKC nuevas θ Y δ. Nuestros resultados muestran que los dominios C1B de las PKCs nuevas tienen diferentes afinidades de unión por membranas modelos, dependiendo de la presencia o no de diacilglicerol y de específicos fosfolípidos negativos. Esto es también observado en células RBL-2H3, en las cuales se han expresado los diferentes dominios C1B. Con todo ello podemos hacer dos grupos de dominios C1B de PKCs nuevas de acuerdo a sus afinidades en unión a membranas: por un lado los dominios C1B de las PKCε y PKCη con una gran afinidad de unión a membranas y aquellos con una baja afinidad, los dominios. 3.3.- Rol de los residuos con carga positiva localizados en el dominio C1Bε y su implicación en la unión de membranas. Los aminoácidos con carga positiva presentes en la parte superior del dominio C1Bε están involucrados en la interacción membrana-proteína Concretamente la lisina K251 y las argininas 268, 282 y 283, y R283, y así ha quedado de manifiesto cuando la substitución de estos residuos por alanina reduce de manera significante la afinidad de unión en los mutantes simples, incrementando en los dobles, hasta anularse por completo en los mutantes triples, incluso en presencia de diacilglicerol. Title: ACTIVATION BY LIPIDS OF PROTEIN KINASE C 1. OBJECTIVES  Determination of the importance of PIP2 in the activation of PKCα through its C2 domain in presence of different lipids and concentrations of calcium ion.  Characterization of the different binding affinities of C1B domains of novel PKCs, their specificity and dependence by DOG and negatively charged phospholipids.  Identification of the amino acidic residues involved in the interaction of C1Bε domain with negatively charged phospholipids. 2. METHODOLOGY  Recombinant DNA cloning of C1B domains and sub cloning to expression vector (pECFP-N). Using the FRET method, the binding of C1B domains to small unilamellar vesicles containing different lipid compositions was studied.  Baculovirus expression system for PKCα production and purifcation by FPLC. The wild type PKCα and the mutant of the lysine-rich cluster were used in assays of kinase activity using radioactive isotopes. 3. RESULTS 3.1. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate decreases the concentration of Ca2+, phosphatidylserine and diacylglycerol required for protein kinase C α to reach maximum activity. The results obtained in this work are compatible with the sequential mechanism previously described in our laboratory. Basically, intracytosolic Ca2+ elevations are the trigger to translocate PKCα to the plasma membrane. Once there, two situations can be found: in microdomains enriched only with phosphatidylserine, the docking of the C2 domain is not enough to liberate the catalytic domain for substrate access, and as seen in the 3D structure recently solved, the C1B domain might still keep blocking the catalytic domain. Due to this, the presence of DAG in the lipid vesicles by docking at least the C1A domain enables the enzyme to gain its full activation. A second situation can be found when the microdomains are enriched in phosphatidylserine and PIP2 at the plasma membrane. In this case, the C2 domain docks in a different orientation since it has to anchor through two different points, i.e. the CBR (Ca2+/PS) and the lysine rich cluster (PIP2), this might induce a conformational change that unleash the C1 domain from the blocking conformation and enables the catalytic domain to access the substrate and consequently full activation of the enzyme. 3.2. The C1B domains of novel PKCε and PKCη have a higher membrane binding affinity than those of the also novel PKCδ and PKCθ. Our results show that the C1B domains from novel PKCs have different binding affinities for model membranes depending on the presence or not of diacylglycerol and of specific anionic phospholipids, and this is also observed in RBL-2H3 cells in which the different C1B domains were expressed. According to these data, two groups of C1B domains from novel PKCs can be established as a function of their membrane binding affinity: those from PKCε and PKCη with a higher membrane binding affinity and those with PKCδ and PKCθ with a low affinity. 3.3. Role of positive charged amino acid residues in the C1B domain of PKCε on membrane translocation and enzymatic activity. The importance of the C1B domain of PKCε for the translocation to the membrane and activation of the enzyme has been broadly confirmed in this work, and in particular, the presence of 4 positively charged amino acid residues present on the top of the domain. These residues would be able to lead the interaction of the C1B domain to the membranes and the punctual mutations that were generated in them, were important enough to decrease the membrane affinities of the C1B domains in FRET studies and the translocation to plasma membrane of the full-length protein in stimulations of RBL-2H3 cells, as well as its enzymatic activity.
Primary author: Egea Jiménez, Antonio Luis
Director: Gómez Fernández, Juan Carmelo
Corbalán García, Senena
Faculty / Departments / Services: Facultad de Veterinaria
Published in: Proyecto de investigación:
URI: http://hdl.handle.net/10201/37827
Document type: info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
Number of pages / Extensions: 241
Rights: info:eu-repo/semantics/openAccess
Appears in Collections:Ciencias de la Salud

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