Caracterización cinetica y aplicaciones biotecnológicas de Lacasa.

Abstract

Objetivos • Caracterización cinética de la oxidación de diversas fenotiazinas comerciales, catalizada por lacasa, mediante un método espectrofotométrico, útil para posibles ensayos de gestión de la calidad en industrias farmacéuticas. • Desarrollo de un método espectrofotométrico apropiado, para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa, que originan productos cromofóricos inestables. • Optimización de la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes como TCP y PCP, con peróxido de hidrógeno y peroxidasa sin mediadores sintéticos. • Optimización de la biodegradación enzimática de TCP por oxígeno molecular, catalizada por lacasa en presencia de mediadores naturales, sin mediadores sintéticos ni peróxido de hidrógeno. • Determinación enzimática y espectrofotométrica de tioles, y aplicación a ensayos de gestión de la calidad de fármacos tiólicos, superando a otros métodos instrumentales alternativos. • Análisis cuantitativo de ácido ascórbico, en muestras sintéticas y en fármacos, utilizando un nuevo método enzimático y espectrofotométrico, capaz de superar a otros métodos ópticos y electroquímicos. Metodología Ensayos espectrofotométricos Los espectros de absorción fueron registrados con un espectrofotómetro de visible-ultra violeta Perkin-Elmer Lambda 35, otros datos cinéticos o de punto final en la zona del visible fueron obtenidos mediante un lector de microplaca SpectraMax 340PC384. Ensayos de cromatografía líquida líquida de alta resolución (HPLC) Los cromatogramas realizados se llevaron a cabo con un cromatógrafo HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution. Las especies eluídas fueron monitorizadas a diferentes longitudes de onda, tomando el máximo de absorción para cada una de ellas. Ensayos de cromatografía de gases acoplada a detector de espectrometría de masas (GC-MS) Los espectros de masas fueron realizados con un espectrómetro de masas Agilent 5975 acoplado a un cromatógrafo de gases Agilent 7890N. Ensayos espectrofluorométricos Los espectro de fluorescencia fueron registrados con un lector de placas fluorescente GeminiTM XPS. Ensayos oximétricos Las medidas de evolución de consumo de oxígeno fueron medidas con un electro de tipo Clark acoplado a un oxígrafo Hansatech. Caracterización cinética de fenotiazinas y sustratos fenólicos La oxidación de diferentes fenotiazinas y sustratos fenólicos por lacasa procedente de Trametes villosa (TvL), fue seguida por la absorbancia de cada uno de los cationes radical cromofóricos. Parámetros cinéticos como la absorbancia máxima (Amax), o su cuadrado (Amax2) y la velocidad en estado estacionario VSS fueron determinados. Biodegradación enzimática de clorofenoles La biodegradación de contaminantes clorados fue llevada a cabo por dos tipos de enzimas, lacasa (TvL) como enzima principal de estudio, y peroxidasas de sofá y rábano (SBP y HRP, respectivamente), con el fin de contrastar los rendimientos de biodegradación del 2,4,6-triclorofenol y del pentaclorofenol (PCP). Conclusiones • Se ha caracterizado cinéticamente la oxidación de varias fenotiazinas comerciales por lacasa, comprobando los efectos de diversas variables experimentales, sobre la formación enzimática y la destrucción no enzimática, de sus correspondientes radicales cromofóricos. • Se ha conseguido desarrollar un método espectrofotométrico simple, fiable y eficaz para la caracterización cinética de sustratos fenólicos de lacasa que originan productos cromofóricos inestables, superando los inconvenientes de los métodos espectrofotométricos de velocidad inicial. • El uso de peróxido de hidrógeno con peroxidasas de rábano picante (HRP) y de soja (SBP), ha demostrado ser una buena alternativa para la biodegradación enzimática de clorofenoles recalcitrantes, como TCP y PCP. • Se ha conseguido optimizar el proceso, ofreciendo un método rápido, eficaz, sin peróxido de hidrógeno, y medioambientalmente sostenible, superando a otros métodos que utilizan mediadores sintéticos, con alto coste y toxicidad. • La elevada reproducibilidad de los métodos enzimáticos con lacasa para la determinación de tioles y de ácido ascórbico, ha indicado una satisfactoria precisión de los mismos. • La validez de los métodos enzimáticos con lacasa respecto a métodos de referencia, para la determinación de D-penicilamina o de ácido ascórbico en fármacos, ilustra su aplicabilidad para el análisis de muestras reales, especialmente de principios activos reductores como tioles y ácido ascórbico. En consecuencia, se han alcanzado satisfactoriamente, los objetivos propuestos al comienzo de esta Tesis Doctoral. Objectives • Kinetic characterization of the oxidation of several commercial phenothiazines catalyzed by laccase, using a spectrophotometric assay, useful for quality management assays in pharmaceutical industries. • Development of an appropriate spectrophotometric assay, for the kinetic characterization of phenolic substrates, which produce unstable chromophoric products. • Optimization of the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols like TCP and PCP, with hydrogen peroxide and peroxidase in the absence of synthetic mediators. • Optimization of the enzymatic biodegradation of TCP by molecular oxygen, catalysed by laccase in the presence of natural mediators, and without synthetic mediators neither hydrogen peroxide. • Enzymatic and spectrophotometric determination of thiols, and application in quality management assays of thiolic drugs, with improved performance than other instrumental alternative assays. • Quantitative analysis of ascorbic acid, in synthetic samples and drugs, using a new enzymatic and spectrophotometric assay, that offer better specifications than other optical and electrochemical assays. Methodology Spectrophotometric assays Absorption spectra were recorded in a visible-ultraviolet Perkin-Elmer Lambda 35 spectrophotometer and other data adquisition in endpoint or kinetic were recorded with an absorbance microplate reader SpectraMax 340PC384. Liquid chromatography Chromatograms were realized with an HPLC Agilent 1200 Rapid Resolution chromatograph. The monitoring of the eluted species was performed at different wavelengths, taking the maximum absorbance wavelengths of the different substances. Gas chromatography/Mass spectrometry Mass spectra were realized with a Mass spectrometer Agilent 5975 coupled to a gases chromatograph Agilent 7890N. Spectrofluorometric assays Fluorescence spectra were recorded in a fluorescence microplate reader GeminiTM XPS. Oxymetric assays Oxygen evolution was measured with a Clark-type electrode coupled to a Hansatech Oxygraph. Kinetic characterization of phenothiazines and phenolic substrates The oxidation of different phenothiazines and phenolic substrates by laccase from Trametes villosa (TvL), was monitored recording the absorbance of each chromophoric radical cation. Kinetic parameters as maximum absorbance (Amax), maximum square absorbance (Amax2) and the steady-state rate VSS were determined. Enzymatic biodegration of chlorophenols The biodegradation of chlorophenolic pollutants were carried out with two kind of enzymes, laccase (TvL) as the main research one, and peroxidase (SBP and HRP) to constrast the biodegradation yields of 2,4,6-trichlorophenol (TCP) and pentachlorophenol (PCP). Conclusions • The oxidation of several commercial phenothiazines with laccase has been kinetically characterized, checking the effects of many experimental variables, on the enzymatic formation and non-enzymatic breakdown, of their corresponding chromophoric radicals. • A simple, reliable and effective spectrophotometric method has been developed, for the kinetic characterization of phenolic substrates of laccase that generate unstable chromophoric products, overcoming the drawbacks of the spectrophotometric methods of the initial rate. • The use of hydrogen peroxide with horseradish peroxidase (HRP) and soybean peroxidase (SBP), has demonstrated to be a great alternative for the enzymatic biodegradation of recalcitrant chlorophenols, like TCP and TCP. • The process has been optimized, offering a method that is fast, effective, without hydrogen peroxide, and environmentally sustainable, overcoming other methods that use synthetic mediators, with high cost and toxicity. • The high reproducibility of the enzymatic methods with laccase to determine thiols and ascorbic acid, has shown a successful precision of these methods. • The validity of the enzymatic methods with laccase with respect to reference methods, for the determination of D-penicillamine or ascorbic acid in drugs, show their applicability to analyse real samples, especially reductant active ingredients like thiols and ascorbic acid. In consequence, the proposed objectives at the beginning of this Doctoral Thesis have been successfully reached.