Caracterización funcional de los receptores de TNF de pez cebra : Functional characterization of TNF receptors in cebrafish.

Abstract

OBJETIVOS 1. Caracterización de los receptores de Tnf (Tnfr1 y Tnfr2) en la homeostasis vascular durante el desarrollo en pez cebra. 2. Caracterización de las rutas de señalización de Tnfr1 y Tnfr2 involucradas en el desarrollo de las células endoteliales y su homeostasis. 3. Caracterización del papel que juegan Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la ola primitiva de hematopoyesis en el pez cebra. 4. Caracterización de los Tnfrs y sus ligandos (Tnfa y Lta) en la especificación y mantenimiento de las HSCs en el embrión de pez cebra. METODOLOGÍA Para la presente tesis doctoral, se ha utilizado el pez cebra (Danio rerio) como modelo de experimentación animal. Además, para la experimentación in vitro se han usado varias líneas celulares y técnicas de cultivo celulares. En cuanto a las técnicas de biología molecular, podemos destacar la microinyección en estadio de huevo de RNAm, morfolinos y DNA; RT-qPCR e hibridación in situ. También se han usado técnicas de microscopía tales como la microscopía confocal y de fluorescencia; técnicas inmunohistoquímicas y TUNEL para la detección de apoptosis; y técnicas de citometría y aislamiento físico de células mediante fluorescencia (FACS). RESULTADOS Durante la presente tesis doctoral, hemos caracterizado el papel que desempeñan el factor de necrosis tumoral (Tnfa) y sus receptores (receptores del factor de necrosis tumoral, Tnfrs) en el desarrollo de las células endoteliales y del sistema hematopoyético. Para ello hemos usado el pez cebra (Danio rerio), como modelo animal de vertebrados. Por un lado, nuestros resultados nos han llevado a concluir que la deficiencia en el gen de tnfr2 en embriones de pez cebra conlleva la inducción en células endoteliales de un programa apoptótico que depende de caspasa-8, caspasa-2 y P53, pero no caspasa-3. Además, la deficiencia simultánea de Tnfr1 o la activación de NF-ĸB, rescata la apoptosis de las células endoteliales, lo que indica que debe haber un equilibrio entre los dos receptores de Tnf para la correcta homeostasis vascular de este tipo celular. De forma similar, el Tnfa promueve la apoptosis de las células endoteliales humanas a través de Tnfr1, desencadenando la activación de caspasa-2 y P53. Por otro lado, en este trabajo demostramos que la señalización de Tnfa a través de Tnfr2 se necesita de forma intrínseca por las células madre hematopoyéticas (HSCs) para su mantenimiento y expansión. La deficiencia genética de Tnfa o Tnfr2, pero no de linfotoxina (Lta) o Tnfr1, conlleva la apoptosis de las HSCs cuando se especifican en el embrión. CONCLUSIONES 1. El silenciamiento génico dirigido contra Tnfr2 resulta en la inducción de un programa apoptótico dependiente de caspasa-8 en células endoteliales. Esta apoptosis se rescata mediante la eliminación de Tnfr1, lo que indica que se requiere un balance adecuado entre los Tnfrs para la integridad de las células endoteliales y la homeostasis vascular. 2. En las células endoteliales, el Tnfr1 señaliza apoptosis a través de la formación del complejo II y la consecuente activación de caspasa-8 y caspasa-2, mientras que Tnfr2 señaliza supervivencia mediante el comple I y la activación de NF-ĸB. 3. El programa apoptótico inducido por Tnfr1, en el cual participa caspasa-8, caspasa-2 y P53, se encuentra conservado evolutivamente en células endoteliales humanas. 4. La señalización de Tnfrs es dispensable para la hematopoyesis primitiva en el embrión de pez cebra. 5. La inhibición génica de Tnfa o Tnfr2, pero no Tnfr1 o Lta, resulta en la apoptosis de las HSCs cuando éstas emergen de la aorta dorsal. 6. La señalización Tnfa/Tnfr2 se requiere de forma intrínseca para la supervivencia de las HSCs a partir del endotelio hemogénico. OBJECTIVES 1. Characterization of Tnfa receptors (Tnfr1 and Tnfr2) in vascular homeostasis during the zebrafish embryo development. 2. Characterization of the Tnfr1 and Tnfr2 signaling pathways involved in endothelial cell development and homeostasis. 3. Characterization of the role played by Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in the primitive wave of hematopoiesis in the zebrafish embryo. 4. Characterization of Tnfrs and their ligands (Tnfa and Lta) in HSCs specification and maintenance in the zebrafish embryo. METHODOLOGY In this Doctoral Thesis, zebrafish (Danio rerio) has been utilized as research animal model. In addition, several cell lines and tissue culture techniques have been used for the in vitro experimentation. Related to the molecular biology techniques utilized, the injection at one-cell stage with mRNA, morpholinos and DNA; RT-qPCR and in situ hybridization can be emphasized. Moreover, other techniques used have been used such as confocal microscopy and fluorescence microscopy; immunohystochemistry techniques and TUNEL for apoptosis detection; as well as cytometry-related assays as fluorescence activated cell sorting (FACS). RESULTS During this Doctoral Thesis, we have characterized the role of Tnfa and Tnf receptors (Tnfrs) during endothelial and hematopoiesis development in the embryo using zebrafish (Danio rerio) as a vertebrate model. Targeted gene knockdown of Tnfr2 in zebrafish embryos results in the induction of a caspase-8, caspase-2 and P53-dependent apoptotic program in endothelial cells that bypasses caspase-3. Furthermore, the simultaneous depletion of Tnfr1 or the activation of NF-ĸB rescue endothelial cell apoptosis, indicating that a signaling balance between both TNFRs is required for endothelial cell integrity. Similarly, Tnfa promotes the apoptosis of human endothelial cells through Tnfr1 and triggers caspase-2 and P53 activation. On the other hand, we show that Tnfa signaling through Tnfr2 is intrinsically required for hematopoietic stem cells (HSCs) maintenance and expansion. The genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of lymphotoxin α (Lta) or Tnfr1, results in the apoptosis of HSCs soon after their emergence. CONCLUSIONS 1. Target gene silencing of Tnfr2 results in the induction of a caspase-8-dependent apoptotic program in endothelial cells. This apoptosis can be rescued by depletion of Tnfr1, indicating that an appropriate signaling balance between both Tnfrs is required for endothelial cell integrity and vascular homeostasis. 2. In endothelial cells, Tnfr1 signals apoptosis through complex II formation and caspase-8 and caspase-2 activation, while Tnfr2 signals survival via complex I and NF-ĸB activation. 3. The apoptotic program induced by Tnfr1, which involves caspase-8, caspase-2 and P53, is evolutionary conserved in human endothelial cells. 4. Tnfrs signaling is dispensable for primitive hematopoiesis in the zebrafish embryo. 5. Genetic inhibition of Tnfa or Tnfr2, but not of Tnfr1 or Lta, results in HSC apoptosis soon after their emergence from the floor of the dorsal aorta. 6. Tnfa/Tnfr2 signaling is intrinsically required for HSC survival after their emergence from the hemogenic endothelium.