Fórmulas infantiles hipoalergénicas con alto grado de hidrólisis proteica y elevado contenido de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga para la prevención terciaria en lactantes con alergia a las proteínas de la leche de vaca.

Abstract

OBJETIVOS: Validación e investigación aplicada de una fórmula terapéutica que, cumpliendo las exigencias de la ESPGHAN, tenga como ingredientes claves de acción funcional un elevado contenido en AGPI-CL, DHA y AA, así como una elevada hidrolización de la proteína de la leche de vaca, en la prevención terciaria de la enfermedad. METODOS: La hipoalergenicidad se determinó a partir del análisis de proteína inmunoreactiva (ELISA Test); la distribución de pesos moleculares por cromatografía líquida de alta resolución con columnas de exclusión por tamaño (Shodex KW 802.5) y detector de diodo array y prueba de anafilaxia sistémica con cobayas. La valoración nutricional se determinó mediante el método ‘AOAC 960.48, de eficiencia proteica. Además, se identificaron péptidos bioactivos en la fórmula tras ser sometida a una digestión in vitro mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC), conectado a un detector de masas, cuadrupolo de trampa iónica, Bruker Dalotnik GmbH, Bremene, Germany. Finalmente la tolerancia y valoración nutricional de la fórmula se determinó mediante la realización de un ensayo clínico abierto, multicéntrico, nacional con lactantes con alergia a la proteína de la leche de vaca (APLV); la tolerancia de la fórmula se estableció mediante la prueba de provocación con la fórmula y con el registro de síntomas durante los 3 meses de seguimiento. La valoración nutricional se lleva a cabo mediante medidas antropométricas (peso, talla y perímetro craneal) y parámetros bioquímicos. Para conocer el estatus de AGPI-CL en los lactantes con APLV tras el tratamiento, se determinó su contenido en la membrana de los eritrocitos, mediante cromatografía de gases Hewlett-Packard 5890A (USA), con una columna capilar SUPELCO PHASE SPTN2330 F.S. de 60 metros de longitud y 0.32 mm de diámetro interno, impregnada con 0.20 μm de espesor de la fase estacionaria biscianopropilfenil polisiloxano y detector de ionización de llama. Con el fin de conocer su posible efecto modulador se determinaron citocinas en plasma mediante detección simultánea de multianalitos utilizando Kits de ensayo MILLIplex y la Tecnología xMAP de Luminex; el sistema completo incluyó el Luminex 200, la plataforma XY para placas, y el sistema de suministro de fluido Luminex SD, software IS y PC. Luminex® Corporation. Todos los cálculos estadísticos se llevaron a cabo usando el programa estadístico SPSS 18.0 para Windows. Valores de p<0.05 se consideraron significativos. RESULTADOS: Desde un punto de vista nutricional, los hidrolizados utilizados en la nueva fórmula terapéutica mostraron un valor biológico superior al 70% y una proporción de eficiencia en proteína mayor a 2.5. Además en el ensayo clínico las puntuaciones Z en peso, talla y perímetro craneal fueron óptimas de acuerdo a las tablas de crecimiento de la WHO. En cuanto a la alergenicidad, la fórmula mostró un contenido reducido en proteína inmunoreactiva y una distribución de pesos moleculares < 3000 Da. La prueba de anafilaxia sistémica en cobayas apoyaron los resultados anteriores y la tolerancia de la fórmula fue de un 97.7% de los lactantes con APLV del estudio. El contenido en DHA y AA en la membrana de los eritrocitos tras los 3 meses de tratamiento tendió al aumento, situándose en niveles similares a los observados en niños amamantados. Desde un punto de vista inmunológico, la citocina IL-8 y el contenido en eosinófilos disminuyeron significativamente tras los tres meses de tratamiento (IL-8: 33.78±22.58 vs 5.66±1.40 pg/ml, U de Mann Whitney U p=0.03; eosinófilos: 1457,54 ±2570,21 vs 417,39 ±402,98 cel/mm3). IL-10 citocina inmunomoduladora tendió al aumento. Se detectaron numerosos péptidos bioactivos, entre ellos uno con un posible papel inmunomdulador. OBJETIVES: Nutritional and antigenic validation of a new therapeutic formula for the nutritional treatment of infant with cow’s milk protein allergy (CMPA) and the role of long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs) in the third prevention of the disease and tolerance. METHODS: Hypoallergenicity was determined by analysis such as immunoreactive protein detected by ELISA test; molecular weight distribution by means of high performance liquid chromatography (HPLC) with size exclusion column (Shodex KW 802.5) and diode array detector; Active Systemic Anaphylaxis (ASA) assay in guinea pigs. Nutritional assessment was performed by AOAC 960.48, Protein Efficacy Ratio. Rat Bioassay. Indeed bioactive peptides were identified in therapeutic formula after in vitro gastrointestinal digestion, using a HPLC connected with mass spectrophotometer detector – ion trap, Bruker Dalotnik GmbH, Bremene, Germany. Finally safety, tolerance and nutritional assessment were established in an opened, multicentre, national clinical trial in infants with CMPA. Safety was established by oral challenge test; tolerance by adverse events and new episodes of allergy register for 3 months of treatments and nutritional aspects by anthropometric and biochemical parameters measured before and after 3 months of nutritional treatment. LCPUFAs status in infants before and after and the nutritional treatment with this new therapeutic formula was established by detection of these fatty acids in red blood cell membrane, using a gas chromatography HP 5890A (USA), SUPELCO PHASE SPTN2330 F.S. 60 m x 0.32 mm ID, 0.20 μm phase film, coupled with flame ionization detector. With the aim to know immunomodulatory effect, Plasma levels of IL-8, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β and IL-17A were measured by immunoassay, with a MILLIplexTM kit using the Luminex 200 system based in the xMap technology. Differences between before and after nutritional treatment were assessed by a non-parametric U Mann Whitney test. Significance was defined as p<0,05. RESULTS: From the nutritional point of view, hydrolysates and therapeutic formula showed a biological value higher than 70% and protein efficiency ratio higher than 2.5. Indeed weight, height and head circumference z-score in the clinical trial were adequated according to WHO growth tables and biochemical parameters were also right. From allergenicity point of view, hydrolysates and therapeutic formula showed very little amount of immunoreactive protein and molecular weight distribution lower than 3000 Da. ASA assay supported the previous results and the therapeutic formula was safety and tolerated by 97.7% of infants with CMPA. Levels of LC-PUFAs (DHA and AA) in red blood cells tended to increase after 3 months of nutritional treatment and levels were closed to amounts found in breast fed infants. From immunological point of view, IL-8 and eosinophils levels in plasma significantly decrease after 3 months of treatment (IL-8: 33.78±22.58 vs 5.66±1.40 pg/ml, U de Mann Whitney U p=0.03; eosinophils: 1457,54 ±2570,21 vs 417,39 ±402,98 cell/mm3). IL-10, immunomodulatory cytokines, tended to increase and several bioactive peptides, molecular weight < 1000 Da, were identified, one of them with immunomodulatory effect.