Estudio de la crioconservación y viabilidad de espermatozoides de epidídimo de caballo.

Abstract

El objetivo general de este trabajo fue estudiar la calidad de espermatozoides procedentes de epidídimo de caballo refrigerado (4ºC) durante varios días (hasta 96 horas) antes y después de la crioconservación. En la primera experiencia se estudió el efecto del tiempo de conservación del epidídimo, refrigerado a 4ºC hasta 96 horas, sobre la cantidad y calidad de los espermatozoides antes y después de la congelación. Para ello analizamos el volumen, la concentración, la viabilidad y la condensación de la cromatina en espermatozoides procedentes de epidídimo conservados a 4ºC durante 0, 24, 48, 72 y 96 horas. Además, se analizó la viabilidad y condensación de la cromatina de los espermatozoides a los 30 minutos de haber sido diluidos en el medio de congelación. Por último, de los espermatozoides congelados-descongeladas se evaluó: la viabilidad, la condensación de la cromatina, la integridad acrosomal, los ROS, la fosforilación de tirosina bajo condiciones capacitantes y la formación de pronúcleos tras la fecundación in vitro (FIV) y tras la inyección intracitoplasmática (ICSI) en un sistema heterólogo con ovocitos bovinos. Los resultados mostraron que el volumen medio (720±159 µl) y la concentración espermática (6’5±0’4 x 109 espermatozoides/ml) no se vieron modificadas a lo largo del tiempo. La viabilidad espermática no mostró descenso hasta transcurrido 72 h. En relación a la condensación de la cromatina no hubo diferencias entre los grupos experimentales. Al diluir los espermatozoides en el medio de congelación observamos un descenso en la viabilidad a partir de las 48 horas, una hipercondensación de cromatina en todos los grupos. Por último, al analizar los espermatozoides descongelados, observamos que la viabilidad, condensación de la cromatina, integridad acrosomal, la viabilidad y la generación de ROS tampoco se vio afectada por el tiempo de conservación. Además, se estudio la fosforilación de tirosina de proteínas de los espermatozoides descongelados tras ser incubados en un medio capacitante y en todos los tiempos de conservación estudiados se produjo fosforilación de tirosina pero no hubo diferencias entre ellos. En cuanto a la capacidad fecundante observamos que los espermatozoides procedentes de todos los grupos experimentales eran capaces de activar a los ovocitos y formar pronúcleos (masculino y femenino). La segunda experiencia se planteó para realizar un estudio sobre la incubación de los espermatozoides de epidídimo durante 30 minutos en plasma seminal como fase previa a la criopreservación. Los resultados obtenidos en cuanto a viabilidad posdescongelación fueron muy variables ya que ésta se incrementaba o disminuía dependiendo del macho del que procedía el plasma seminal. En cuanto a los parámetros condensación de la cromatina, integridad del acrosmal y generación de ROS, no se vieron afectados ni por la incubación con el plasma seminal ni por el animal del que procedía dicho plasma. En la tercera experiencia analizamos la composición del plasma seminal de los tres machos utilizados: los niveles de antioxidantes, concentración lipídica y concentración proteica. Los resultados mostraron que el plasma que mejoraba la viabilidad espermática tras la descongelación era el que presentaba mayor concentración de antioxidantes, mayor cantidad de ácidos grasos polinsaturados y mayor cantidad de proteína. Además se analizó la composición proteica del plasma seminal, mediante la técnica de 2D-DIGE, de los tres machos. Fueron identificados 34 spots en total y se identificaron aquellas proteínas que diferían entre ellos (dependiendo de su punto isoeléctrico y peso molecular). Se observó una gran variabilidad entre los tres animales. Podemos concluir que se mantiene la calidad de los espermatozoides procedentes de epidídimo conservados a 4ºC hasta 96 horas tras la descongelación y, dependiendo del animal, la incubación de los espermatozoides en el plasma seminal puede ser beneficioso durante el proceso de la crioconservación. The main goal of this work was to study the effect of sperm storage, at 4ºC up to 96 h, in the epididymides obtained from castrated horses and its effect on different functional sperm parameters.

Our first experiment were designed to study the effect of (1) sperm storage on viability and chromatin condensation; (2) pre-incubation of recovered epididymal sperm in the freezing extender, prior cryopreservation, on viability and chromatin condensation; (3) freezing–thawing on viability, chromatin condensation, ROS generation, protein tyrosine phosphorylation and heterologous fertilization rate (ICSI and IVF using bovine oocytes) of sperm recovered from the epididymis up to 96 h post castration. The average volume (720±159 µl and the concentration (6’5±0’4× 109 spermatozoa/ml) of sperm recovered from the epididymis were not affected by storage. Sperm viability after refrigeration at 4ºC for up to 72 h was similar. The effect of sperm dilution in the freezing media showed similar values up to 48 h, while viability was preserved up to 72 h. Cryopreserved spermatozoa show similar viability between different storage times. Chromatin condensation was not affected by storage time; however, incubation for 30 min in freezing medium and freezing–thawing process induced an increase in the chromatin condensation. ROS generation was not affected by storage up to 96 h. Epididymal storage did not affect sperm protein tyrosine phosphorylation patterns; although the pattern of phosphorylation changed to strong staining of the equatorial segment when the sperm where capacitated in sperm–TALP. Finally, successful and similar pronuclear formation (analyzed by ICSI) and in vitro penetration (evaluated with bovine zone free oocyte) was observed using cryopreserved sperm obtained from prolong epididymal storage at 4ºC. In conclusion, cryopreservation of epididymal stallion sperm stored for up to 72 h in the epididymis at 4ºC, maintain both viability and ability to fertilize in vitro. In the second experiment we studied the effect of sperm incubation with seminal plasma before cryopreservation on sperm viability, chromatin condensation, acrosomal integrity and ROS. Results showed that these parameters were not affected by sperm incubation with seminal plasma. However, we observed that viability was affected by male because it increased or decreased depending on plasma donor. The parameters chromatin condensation, acrosomal integrity and ROS generation, were not affected by either seminal plasma or by the animal. The third experiment was designed to evaluate seminal plasma composition, particularly antioxidant level, lipid and protein concentration. The seminal plasma which had the largest quantity antioxidant level, lipid and protein was the one which improved sperm viability after thawing. The seminal plasma composition was different depending on the animal. In addition, using the technique of 2D-DIGE, protein composition from the seminal plasma was analyzed. We identified which proteins were different between them (depending on their isoelectric point and their molecular weight). A total of 34 spot were identified and were different between animal. In conclusion, equine spermatozoa stored in the epididymis for up to 96 h at 4ºC can be successfully cryopreserved and maintain their fertilization capacity after thawing. Also, sperm incubation in seminal plasma would improve sperm quality depending on animal.