Inmovilización de enzimas en ésteres cinámicos de carbohidratos : nuevos soportes fotoentrecruzables

Abstract

La inmovilización de enzimas es de gran interés por razones económicas,prácticas e incluso ética. Se han sintetizado derivados totalmente cinamoilados de distintos polialcoholes, monosacáridos, derivados de estos últimos con grupos reactivos previamente seleccionados, derivados de oligosacáridos,polisacáridos, así como derivados preparados con diferentes grado de cinamoilación dependiendo del ensayo a realizar. Estos soprotes, sólos o mezclados entre ellos, se irradiaron con luz ultravioleta hasta obtener el soporte final utilizado para la inmovilización de diferentes enzimas. Los soportes se analizaron mediante espectroscopía de UV-visible, resonancia magnéticanuclear de protón y carbono-13, "DEPT", COSY, correlación C-H, espectroscopía de infrarrojo, espectrometría de masas, FAB+ y análisis térmico diferencial (DSC). Se optimizó la preparación de las extensiones de soportes de inmovilización,así como eligió bolas de vidrio de 3 mm de diámetro para su disposición. Principalmente, los trabajos se realizaron con la enzima HRPc inmovilizada mediante adsorción física, enlace covalente y atrapamiento. Se optimizó además el sistema de lavado de los inmovilizados preparados en función de la enzima ensayada, permitiendo caracterizar la retención de la enzima sobre el soporte de inmovilización mediante interacciones hidrofóbicas. Se estableció las mejores condiciones para la inmovilización de HRPc: pH y tiempo de inmovilización, concentración de enzima, concentración y número de capas de soporte, así como el tiempo de irradiación, que se consideró determinante para los resultados finales obtenidos. Como resultados, se pudo obtener una clasificación de los soportes en función de la actividad retenida en ellos, dependiendo de su naturaleza química, se ensayó el efecto inactivador de la temperatura, realizándose un estudio completo de la cinética que tiene lugar para los derivados totalmente. Several crosslinking photopolymers were prepared and used as immobilization supports: totally and partially cinnamoylated derivatives of polyalcohols, monosaccharides, oligosaccharides and polysaccharides. We analyse the supports by UV–visible spectroscopy, 1H NMR, 13C NMR, "DEPT", COSY, C-H correlation, FT-IR, mass spectrometry, FAB+ and Differential Thermal Analysis (DSC). A film of prepolymer was formed onto glass beads (3mm diameter). The polymerization and cross-linking was carried out by irradiation in the ultraviolet region to obtain the final supports to immobilize enzymes. Immobilization of HRPc involves a process of physical adsorption and intense hydrophobic interactions. HRPc concentration, support concentration, immobilization time, pH, irradiation time and chemical nature of the immobilization supports on the retained enzymatic activity, was studied. Moreover, the thermal stability of immobilized HRPc onto glass beads covered with totally cinnamoylated derivatives of D-sorbitol (SOTCN), D-glucosone (GSOCN), ethyl-D-glucopyranoside (EGSCN) and inuline (INCN) was studied. and for H2O2 and ABTS, were calculated. We study the inactivation by hydrogen peroxide of immobilized HRPc, and the stability and durability of immobilized HRPc during storage in distilled water. Using HRPc immobilized onto glass beads coated with totally cinnamoylated derivatives of D-glucosone and sucrose, chitosan (coagulant) and different initial phenol concentrations, a reduction of more than 70% of the initial phenol concentration was obtained. The supports initially prepared were modified to make them suitable to immobilize ?-galactosidase