Quantification of lupin peroxidase isoenzymes by densitometry

Abstract

The formation of benzidine-brown end product by lupin peroxidase isoenzymes, separated by gel isoelectric focusing, is used in order to quantify isoenzyme activities on the same gel. Incubation times of 3 h, H2O2 concentration of 1 mM, ben~ -as saturated solution, and pH 5.0, are the best assay conditions. Under these conditions, isoperoxidase activity can be quantified as formation (and/or acéumulation) of the benzidine-brown end product in the steady-state ofthe reaction. The product can be measured as the peak area recorded· by scanning densitometry at 460 nm. Linear relationship between the amount of total peroxidase activity loaded on the top of the gel, and the area of each isoperoxidase peak resolved by gel isoelectric focusing support the validity of this densitometric method for the quantification of lupin peroxidase isoenzymes.

La formación del producto final de la oxidación de la benzidina ( «benzidine-brown») por las isoenzimas de la peroxidasa de altramuz separadas por isoelectroenfoque, se utilizó para cuantificar las actividades enzimáticas de cada una de las isoenzimas en un mismo gel. Se encontraron como condiciones de reacción más adecuadas, el uso de tiempos de reacción de 3 h, concentraciones de H,O, del orden de 1 mM, y concentraciones de benzidina a saturación en tampones de pH 5.0. Bajo estas condiciones, la actividad de cada isoperoxidasa puede ser cuantificada como formación (y/o acumulación) de dicho producto en el estado estacionario de la reacción, siendo éste medido como área de cada pico registrado por barrido densitométrico a 460 nm. La validez de este método densitométrico para la cuantificación de las isoenzimas de la peroxidasa de altramuz, está apoyada por la existencia de una relación lineal entre la cantidad total de actividad peroxidasa depositada sobre el gel, y el área correspondiente a cada pico de isoperoxidasa separada por isoelectroenfoque.