Combination of biotechnological techniques for the elimination of microorganisms from apricot plants

Abstract

El albaricoquero (Prunus armeniaca L.) es una especie de gran importancia económica en España, especialmente en la Región de Murcia. No obstante, las plantaciones tradicionales se enfrentan a graves problemas sanitarios por la presencia de virus y viroides, destacando Plum pox virus (PPV), que causa la enfermedad de la Sharka, y Hop stunt viroid (HSVd). El objetivo principal de esta tesis es el desarrollo de aproximaciones biotecnológicas que eliminen PPV y HSVd de variedades de albaricoquero. La mejor estrategia contra los virus es conferir a la planta resistencias frente a estos patógenos. Las nuevas técnicas de ingeniería genética han permitido la producción de plantas de ciruelo resistentes a PPV mediante una construcción que desencadena un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional de genes del virus. En este trabajo se ha estudiado si la resistencia a Sharka se podría transmitir desde patrones transgénicos de ciruelo a variedades no transgénicas de albaricoquero mediante injerto. Los resultados mostraron una efectividad de hasta un 92% de plantas libres de PPV, así como la acumulación de siRNAs en los injertos. La utilización de material certificado libre de patógenos en las nuevas plantaciones es necesario para garantizar un adecuado estado sanitario de las mismas. Para ello se requiere contar con distintos protocolos biotecnológicos que permitan la eliminación de virus y viroides de albaricoquero. La técnica que se ha utilizado tradicionalmente para el saneamiento de material vegetal es el cultivo de meristemos. Sin embargo, en esta tesis se determinó que la eficiencia del cultivo de meristemos sobre la eliminación de PPV y HSVd en brotes de albaricoquero in vitro es nula o muy baja. La combinación del cultivo de meristemos con otras técnicas es necesaria para aumentar la eficiencia de eliminación de PPV y HSVd en esta especie. El uso de nanopartículas de plata (AgNPs) puede ser una alternativa para la eliminación de virus de plantas, dada su capacidad viricida. En la tesis se ha optimizado un protocolo de micropropagación para albaricoquero utilizando un medio líquido sin cloruros que permitió la introducción de AgNPs en el tejido vegetal, siendo la concentración de plata metálica 23 veces mayor que en el control. Además, se comprobó que la exposición a AgNPs condujo a un aumento de la proliferación, producción de biomasa y acumulación de nutrientes en brotes de albaricoquero in vitro. Por último, se estudió el efecto de las AgNPs sobre la eliminación de PPV y HSVd. Aunque no fue posible la eliminación de HSVd, se consiguió obtener plantas libres de PPV con una eficiencia de hasta el 75%. La termoterapia (exposición a altas temperaturas) y etiolación (crecimiento en oscuridad) se han propuesto como tratamientos efectivos para eliminar PPV y HSVd. El tratamiento combinado y el de 45 días de termoterapia consiguieron las mejores eficiencias de eliminación de PPV (75,0% y 66,7%, respectivamente). Se necesitaron al menos 40 días de termoterapia para obtener plantas libres de HSVd, aunque la mejor eficiencia se obtuvo tras 45 días de termoterapia (22,7%). En esta tesis también se ha desarrollado un protocolo de crioterapia (temperaturas ultrabajas) basado en la técnica “vitrificación en gota” utilizando la solución vitrificante PVS2 que consiguió eliminar PPV con un 81,9% de eficiencia. El trabajo realizado en esta tesis ha permitido establecer distintas estrategias biotecnológicas mediante las que es posible obtener plantas de albaricoquero resistentes o libres de los patógenos PPV y/o HSVd.

The apricot tree (Prunus armeniaca L.) is a species with great economic importance in Spain, particularly in the Region of Murcia. However, the concerning health status of traditional orchards compromises the continuity of production due to the presence of viruses and viroids, particularly Plum pox virus (PPV), which causes Sharka disease, and Hop stunt viroid (HSVd). The main goal of this thesis is the development of biotechnological approaches to eliminate PPV and HSVd from apricot cultivars. The most effective strategy against viruses is to confer resistance to the plant. New genetic engineering techniques have enabled the production of PPV-resistant plum plants through a construct that triggers a post-transcriptional gene silencing mechanism. This study investigated whether Sharka resistance could be transmitted from transgenic plum rootstocks to non-transgenic apricot cultivars via grafting. The results showed up to 92% efficiency in obtaining PPV-free plants, as well as the accumulation of siRNAs in the grafts. The use of certified pathogen-free plant material is essential for ensuring the health status of new plantations. This requires various biotechnological protocols to eliminate viruses and viroids from apricot trees. The traditional technique for sanitising plant material is meristem culture. However, this thesis determined that the efficiency of meristem culture in eliminating PPV and HSVd from in vitro apricot shoots is negligible or very low. Therefore, combining meristem culture with other techniques is necessary to enhance the elimination efficiency of PPV and HSVd in this species. The use of silver nanoparticles (AgNPs) may be a promising alternative for plant virus elimination. In this thesis, a micropropagation protocol for apricot was optimised using a chloride-free liquid medium, which allowed the introduction of AgNPs into plant tissue, resulting in a metallic silver concentration 23 times higher than in the control. Furthermore, exposure to AgNPs led to increased proliferation, biomass production, and nutrient accumulation in in vitro apricot shoots. Finally, the effect of AgNPs on PPV and HSVd elimination was studied. Although HSVd elimination was not achieved, PPV-free plants were obtained with an efficiency of up to 75.0%. Thermotherapy (exposure to high temperatures) and etiolation (growth in darkness) have been proposed as effective treatments for eliminating PPV and HSVd. The combined treatment and the 45-day thermotherapy treatment achieved the highest PPV elimination efficiencies (75.0% and 66.7%, respectively). At least 40 days of thermotherapy were required to obtain HSVd-free plants, with the highest efficiency observed after 45 days (22.7%). Additionally, this thesis developed a shoot tip cryotherapy protocol (ultra-low temperatures) based on the droplet vitrification technique using the vitrification solution PVS2, which successfully eliminated PPV with an efficiency of 81.9%. The research carried out in this thesis has established various biotechnological strategies through which it is possible to obtain apricot plants that are either resistant to or free from PPV and/or HSVd.