Optimization of the generation of genetically modified pigs

Abstract

La presente tesis doctoral se presenta como un compendio de cuatro publicaciones científicas que contribuyen a una línea de investigación centrada en la edición genética de embriones porcinos mediante técnicas de electroporación y lipofección. El objetivo de esta tesis fue optimizar las metodologías de edición genética en embriones porcinos mediante el uso del sistema CRISPR/Cas9 y de las técnicas de electroporación y lipofección. La mejora de la eficiencia de estas técnicas permitirá su aplicación en los campos de la biomedicina y la producción animal, incluyendo la generación de modelos de enfermedades, la resistencia a enfermedades virales y el avance en xenotrasplantes. Los estudios se realizaron fundamentalmente siguiendo un procedimiento estándar de producción in vitro de embriones porcinos. Se aplicaron diferentes protocolos de edición genética con CRISPR/Cas9 y se evaluó la eficiencia de la electroporación y la lipofección en términos de desarrollo embrionario y parámetros de mutación. Se realizó el genotipado de los embriones mediante PCR fluorescente y electroforesis capilar en gel para verificar las modificaciones genéticas en los embriones porcinos y se evaluó su desarrollo hasta la fase de blastocisto. Se demostró que la electroporación antes de la fecundación in vitro (FIV) permite generar embriones porcinos con mutaciones simples, dobles y múltiples de manera eficiente. La tasa de mutación no depende del número de guías por tratamiento, sino de la guía específica utilizada, y la concentración de ARN guía (sgRNA) y de la proteína Cas9 juega un papel crucial en la eficiencia del sistema de edición genética, afectando tanto a la tasa de mutación como al grado de mosaicismo. Además, la combinación de la electroporación con la FIV favorece el desarrollo embrionario temprano, ya que aumenta la activación ovocitaria y la proporción de ovocitos con un solo pronúcleo a las 18 horas post-inseminación, lo que incrementa la formación de partenotes sin alterar la tasa de blastocisto. En términos de optimización técnica, se identificó que el Opti-MEM es mejor medio de electroporación que el Duplex Buffer en términos de desarrollo embrionario. Asimismo, el momento de realización del procedimiento de electroporación con respecto a la FIV no influye en el desarrollo embrionario ni en la activación partenogénica, pero sí afecta a la tasa de mutación, siendo más eficiente si se realiza 7 horas después de la FIV. Por otro lado, se comprobó que es posible generar embriones porcinos modificados genéticamente mediante lipofección de ovocitos con zona pelúcida intacta durante la FIV, con una concentración óptima de liposomas-RNP del 5 % v/v. No se encontraron diferencias significativas entre las lipofectaminas comerciales CRISPRMAXTM y 3000 en términos de tasa de mutación y desarrollo embrionario, aunque se determinó que el tiempo de co-incubación óptimo con la lipofectamina CRISPRMAXTM es de 8 horas en nuestras condiciones experimentales. Los resultados de esta tesis contribuyen significativamente al campo de la biotecnología reproductiva y la edición genética, con aplicaciones en los ámbitos biomédico y ganadero.

This thesis is presented as a compendium of four scientific publications that contribute to a line of research focused on the gene editing of porcine embryos using electroporation and lipofection techniques. The objective of this thesis was to optimize the methods of gene editing in porcine embryos using the CRISPR/Cas9 system and electroporation and lipofection techniques. Improving the efficiency of these techniques will enable their application in biomedicine and animal production, including the generation of disease models, viral disease resistance models, and advances in xenotransplantation. The studies were conducted using a standard procedure of in vitro production of porcine embryos. Different CRISPR/Cas9 gene editing protocols were applied and the efficiency of electroporation and lipofection was evaluated in terms of embryo development and mutation parameters. Genotyping was performed by fluorescent-PCR and capillary gel electrophoresis to verify the genetic modifications in porcine embryos, and their development up to the blastocyst stage was assessed. It was shown that electroporation prior to in vitro fertilization (IVF) allows efficient generation of porcine embryos with single, double and multiple mutations. The mutation rate does not depend on the number of guides per treatment, but rather on the specific guide used. The concentration of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 protein plays a critical role in the efficiency of the gene editing system, affecting both the mutation rate and the degree of mosaicism. In addition, the combination of electroporation and IVF enhances early embryonic development by increasing oocyte activation and the proportion of oocytes with a single pronucleus at 18 hours post-insemination, resulting in increased parthenote formation without altering the blastocyst rate. In terms of technical optimization, Opti-MEM was found to be a better electroporation medium than Duplex Buffer for embryo development. In addition, the timing of the electroporation procedure relative to IVF does not affect embryo development or parthenogenetic activation, but it does affect the mutation rate, which is more efficient when performed 7 hours after IVF. In addition, it was confirmed that genetically modified porcine embryos could be generated by lipofection of zona pellucida-intact oocytes IVF, with an optimal liposome-RNP concentration of 5% v/v. No significant differences were found between the commercial lipofectamines CRISPRMAXTM and 3000 in terms of mutation rate and embryo development. However, the optimal co-incubation time with lipofectamine CRISPRMAXTM was found to be 8 hours under our experimental conditions. The results of this work make a significant contribution to the fields of reproductive biotechnology and gene editing, with applications in both the biomedical and livestock sectors.