Aplicación de la bioinformática en la descripción y resolución de patologías hematológicas y mecanismos biológicos relacionados

Abstract

La alta capacidad de generación de datos ómicos en los últimos años ha forzado la implementación de sistemas de análisis automatizados que permitan la gestión e interpretación de grandes cantidades de información. Con todo, la generación de grandes cantidades de datos por cada paciente, la incorporación de diferentes ómicas y el modelado por ordenador en biomedicina hacen necesaria la presencia en los laboratorios experimentales de esta disciplina del bioinformático de cabecera, con la finalidad de poder tratar adecuadamente todo este conocimiento.

El presente trabajo sirve como reflejo de estas nuevas necesidades computacionales en grupos experimentales. Concretamente, del grupo de Hematología y Oncología Clínico Experimental de la Universidad de Murcia entre los años 2020 y 2024. En esta Tesis Doctoral se recogen resultados de investigación bioinformática en el área del modelado molecular, la obtención y estudio de variantes germinales, el desarrollo de nuevos programas para el procesado de datos de secuenciación por lecturas largas y su aplicación práctica al estudio de la fisiopatología hepática.

Así, se ha podido comprobar que, si bien se han producido avances de gran importancia en los últimos años en la predicción estructural de proteínas en base a su secuencia, quedan aún pendientes avances para comprender realmente los mecanismos que determinan el plegamiento de una secuencia dada, como muestran los resultados de AlphaFold para diferentes conformaciones de serpinas como la antitrombina, que en este estudio fue incapaz de mostrar ninguna estructura de esta que no fuese la nativa, a pesar de existir, incluso para la secuencia silvestre, otras posibles estructuras que AlphaFold no es capaz de considerar a día de hoy.

Aunque ya se había descrito la relación entre la agenesia de vena cava y un mayor riesgo trombótico, mediante estudios de exomas se ha podido constatar cómo la agenesia de vena cava está relacionada con la aparición de trombofilias en genes de la hemostasia primaria que causarían un evento trombótico durante el desarrollo embrionario. Esta podría ser la razón de la malformación y justificaría por otro lado los eventos trombóticos que ocurren en la etapa adulta.

En esta memoria se recoge igualmente el desarrollo de dos protocolos de análisis para datos de secuenciación por nanoporos, permitiendo un procesado estándar de muestras secuenciadas por esta tecnología, explotando sus capacidades (definición de grandes haplotipos, regiones repetitivas, detección de variantes estructurales), buscando minimizar sus limitaciones, mediante el uso de herramientas de amplio uso en la comunidad científica en torno a estas tecnologías, y facilitando la orquestación de los diferentes pasos en equipos de características muy variables, desde configuraciones modestas a grandes servidores de computación.

Este trabajo es también el primero, hasta donde sabemos, que realiza una descripción detallada del perfil epitranscriptómico del hígado en pacientes con obesidad y distinto grado de enfermedad hepática, lo que podría ayudar a comprender nuevos aspectos sobre la evolución de las condiciones hepáticas y sobre las rutas metabólicas que puedan ser de interés desde el punto de vista diagnóstico o terapéutico.

Por último, se pudo describir igualmente el proceso de diferenciación hepática desde células pluripotentes inducidas a organoides hepáticos. Se observó en la expresión diferencial la aparición en los organoides de anotaciones relacionadas con la formación de estructuras anatómicas asociadas a órganos internos, así como funciones propias del hígado. Al mismo tiempo, se arrojó algo de luz sobre el perfil y cambios epitranscriptómicos en ambos estadios, encontrando que las modificaciones m6A del ARN tendrían relación tanto con la estabilidad de los transcritos, así como parecen tener conexión con el proceso mismo de especialización celular.

The high throughput systems for omics data generation has forced lately the implementation of automated analysis systems allowing the management and interpretability of huge amounts of information. Hence, the generation of large amounts of data for each patient, the incorporation of different omics and computer modeling in biomedicine lead to the presence of bioinformaticians in the experimental laboratories of this discipline, in order to properly process all this knowledge.

The present work is a reflection of these new computational needs in experimental groups. More specifically, in the Hematology and Clinical Experimental Oncology group of the University of Murcia between 2020 and 2024. This Doctoral Thesis includes results of bioinformatic research in the area of molecular modeling, the calling and study of germline variants, the development of new pipelines to process sequencing data from long reads and their practical application to the study of liver pathophysiology.

Thus, this work shows that, although there have been major advances in recent years in the structural prediction of proteins based on their sequence, progress is still to be dome in order to actually understand the mechanisms that determine the folding of a given sequence, as shown by the results of AlphaFold for different conformations of serpins such as antithrombin, which in this study was unable to show any structure different from the native one, despite the existence, even for the wild-type sequence, of other possible structures not considered by simulation systems to date.

While it has already been described the relationship between vena cava agenesis and higher thrombotic risk, it was confirmed via exome sequencing assays how vena cava agenesis is related to the appearance of thrombophilias in primary hemostasis genes. This would cause an early thrombotic event during the embryo development. This would be the reason behind the malformation, and would also explain the thrombotic events observed during adulthood.

This Thesis also includes the development of two novel analysis protocols for nanopore sequencing data, allowing a standard processing of samples sequenced by this technology, exploiting its capabilities (definition of large haplotypes and repetitive regions, or detection of structural variants), seeking to minimize its limitations, by using tools widely accepted by the scientific community around these technologies, and easing the orchestration of the different steps in workstations with highly variable characteristics, from modest laptops to large computer servers.

This work is also the first, to our knowledge, making a detailed description of the epitranscriptomic profile of the liver in patients with obesity and different degrees of liver disease, which could help to understand new aspects on the evolution of liver conditions and on the metabolic pathways that could be of interest from the diagnostic or therapeutic point of view.

Finally, it was also possible to describe the process of hepatic differentiation from induced pluripotent stem cells (iPSC) differentiated to hepatic organoids. It was observed in the differential expression results the appearance on organoids of annotations related to the formation of anatomical structures associated with internal organs, as well as typical liver functions. At the same time, some light was shed on the epitranscriptomic profile and its changes in both stages, finding that the m6A RNA modifications would be related both to the stability of the transcripts, as well as appear to have a connection with the process of cell specialization itself.