New thrombotic biomarkers in gastrointestinal tumors

Abstract

El tromboembolismo venoso es una comorbilidad relativamente frecuente en los pacientes oncológicos, así como la segunda causa de muerte en esta población. Se han empleado diferentes tratamientos anticoagulantes para prevenir esta complicación, pero su baja eficiencia en población no seleccionada y el aumento de sangrado asociado, han llevado a que la tromprofilaxis generalizada sea descartada. Este escenario destaca en los tumores gastrointestinales, ya que, aunque son altamente trombogénicos, también se asocian a un alto riesgo de sangrado. Así, es necesario identificar nuevos marcadores de riesgo trombótico que permitan seleccionar a aquellos pacientes que podrían beneficiarse de la tromboprofilaxis primaria a pesar del riesgo de sangrado. Por ello, el objetivo de esta tesis es identificar nuevos biomarcadores trombóticos en pacientes con cáncer colorrectal y cáncer gástrico avanzado. En cáncer colorrectal, nos centramos en el estudio de la hepsina, una serín-proteasa implicada en invasión tumoral y en la activación de la vía extrínseca de la coagulación. Retrospectivamente, reclutamos casi 300 pacientes con cáncer colorrectal localizado o metastásico. Mediante inmunohistoquímica, medimos la intensidad de tinción de hepsina en la biopsia primaria al diagnóstico y la correlacionamos con variables clínicas como la incidencia acumulada de trombosis, la recaída metastásica, o la supervivencia global, entre otras. Posteriormente, realizamos estudios in vitro e in vivo basados en células de cáncer colorrectal transfectadas establemente con el gen de la hepsina, y determinamos el efecto de su sobreexpresión en ensayos de migración, invasión, proliferación y generación de trombina. Finalmente, de cara a una aplicación como diana terapéutica, utilizamos las técnicas de "virtual screening" y "docking molecular" para identificar fármacos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) que pudiesen inhibir la actividad de hepsina, así como suprimir los efectos de su sobreexpresión en las células tumorales. Como resultados principales, describimos la hepsina como un biomarcador de trombosis y recaída metastásica en pacientes con cáncer colorrectal localizado. En concordancia, la sobreexpresión de hepsina en células de cáncer colorrectal aumentaba significativamente su fenotipo invasivo y su capacidad de generación de trombina. Finalmente, descubrimos Venetoclax y Suramin como dos nuevos inhibidores de hepsina que, además, suprimían sus efectos protumorales y trombogénicos. En conclusión, la hepsina expresada en el tumor primario es un nuevo parámetro potencialmente útil para mejorar la predicción del riesgo trombótico en pacientes con cáncer colorrectal localizado, así como una nueva diana cuya inhibición podría prevenir la metástasis y trombosis en dichos pacientes. En cáncer gástrico avanzado, mediante un "array" de expresión no dirigido, comparamos retrospectivamente la expresión génica en el tumor primario de 48 pacientes que sufrieron tromboembolismo venoso durante el seguimiento y 49 controles sin dicha complicación, apareados por "propensity score matching". Una vez identificados los genes asociados significativamente a la ocurrencia de tromboembolismo venoso, reclutamos una nueva cohorte de 44 pacientes con dicha comorbilidad y 39 controles. En el tumor primario, medimos por PCR digital la expresión absoluta de los genes previamente identificados, y comprobamos si esta seguía la misma tendencia respecto al tromboembolismo venoso que en la primera cohorte, así como su potencial para estratificar a aquellos pacientes de alto riesgo. Como resultados principales, en la primera cohorte, identificamos 15 genes cuya expresión diferencial se asociaba con la ocurrencia de tromboembolismo venoso, siendo además aplicables tanto al subtipo de cáncer gástrico intestinal como difuso. En la cohorte de validación, 3 de estos genes, EPS8, PRKD3 y SAA1, siguieron la misma tendencia de expresión respecto a la trombosis, y además, su expresión absoluta distinguió dos grupos de pacientes con un riesgo de tromboembolismo venoso significativamente diferente. En conclusión, identificamos 3 genes cuya expresión en cáncer gástrico avanzado podría mejorar la predicción del tromboembolismo venoso.

Venous thromboembolism is a relatively common comorbidity in cancer patients and the second leading cause of death in this population. Different anticoagulant treatments have been used to prevent this complication, but their low efficacy in unselected populations and the increased risk of bleeding associated with this tretaments have led to the abandonment of widespread thromboprophylaxis. This scenario stands out in gastrointestinal tumours, as although they are highly thrombogenic, they are also associated with a high risk of bleeding. Therefore, it is necessary to identify new thrombotic risk markers that can help select those patients who could benefit from primary thromboprophylaxis, despite the risk of bleeding. Thus, the objective of this thesis is to identify new thrombotic biomarkers in patients with colorectal cancer and advanced gastric cancer. In colorectal cancer, we focused on the study of hepsin, a serine protease involved in tumour invasion and activation of the extrinsic coagulation pathway. Retrospectively, we recruited nearly 300 patients with localized or metastatic colorectal cancer. Using immunohistochemistry, we measured hepsin staining intensity in the primary biopsy at diagnosis and correlated it with clinical variables such as cumulative incidence of thrombosis, metastatic relapse, overall survival, among others. Subsequently, we conducted in vitro and in vivo studies using colorectal cancer cells stably transfected with the hepsin gene, and determined the effect of its overexpression in migration, invasion, proliferation and thrombin generation assays. Finally, with a view toward therapeutic targeting, we used virtual screening and molecular docking techniques to identify FDA-approved drugs that could inhibit hepsin activity and suppress the effects of its overexpression in tumour cells. As main results, we described hepsin as a biomarker of thrombosis and metastatic relapse in patients with localized colorectal cancer. In line with this, hepsin overexpression in colorectal cancer cells significantly increased their invasive phenotype and thrombin generation capacity. Finally, we identified Venetoclax and Suramin as two new hepsin inhibitors that also suppressed its pro-tumoural and pro-thrombogenic effects. In conclusion, hepsin expressed in the primary tumour is a new potentially useful parameter for improving thrombotic risk prediction in patients with localized colorectal cancer, as well as a new target whose inhibition could prevent metastasis and thrombosis in these patients. In advanced gastric cancer, using a non-targeted expression array, we retrospectively compared gene expression in the primary tumour of 48 patients who developed venous thromboembolism during follow-up and 49 controls without this complication, matched by propensity score matching. Once genes significantly associated with the occurrence of venous thromboembolism were identified, we recruited a new cohort of 44 patients with this comorbidity and 39 controls. In the primary tumour, we measured the absolute expression of the previously identified genes by digital PCR and checked whether they followed the same trend concerning venous thromboembolism as in the first cohort, as well as their potential for stratifying patients at high risk. As main results, in the first cohort, we identified 15 genes whose differential expression was associated with the occurrence of venous thromboembolism, applicable to both intestinal and diffuse gastric cancer subtypes. In the validation cohort, 3 of these genes, EPS8, PRKD3 and SAA1, followed the same expression trend with respect to thrombosis, and their absolute expression distinguished two groups of patients with a significantly different risk of venous thromboembolism. In conclusion, we identified 3 genes whose expression in advanced gastric cancer could improve the prediction of venous thromboembolism.