Factores determinantes del crecimiento y/o estado fisiológico de L.amonocytogenes en alimentos vegetales frescos y posibles estrategias de control

Abstract

Listeria monocytogenes es una bacteria que representa un riesgo significativo para la seguridad alimentaria, especialmente en productos listos para el consumo, como frutas y hortalizas. Su notable resistencia ambiental la convierte en una amenaza persistente en los entornos de procesamiento. Su capacidad para contaminar productos hortofrutícolas en fases de pre y postcosecha, lo que representa un riesgo para la salud pública al causar listeriosis, una infección grave que afecta principalmente a poblaciones vulnerables. El objetivo de esta tesis fue estudiar los factores que influyen en el crecimiento de L. monocytogenes en productos vegetales frescos y desarrollar estrategias para su control en la industria de procesado de frutas y hortalizas. Además, se evaluaron diversas intervenciones post-proceso para reducir la proliferación de esta bacteria durante la vida útil de los alimentos. La investigación se estructuró en cuatro estudios experimentales (Capítulos I-IV). En el Capítulo I, se aplicó un modelo secundario (Modelo Gamma) para evaluar el comportamiento de L. monocytogenes en productos vegetales frescos, considerando como factores inhibidores el pH, la actividad de agua (aw) y la temperatura de conservación. Este modelo fue validado con datos de 105 estudios científicos, obteniendo una concordancia del 83,2% en hortalizas y del 87,5% en hortalizas de hoja, siendo este último grupo identificado como el más susceptible al crecimiento de L. monocytogenes. Aunque el modelo presentó limitaciones en frutas debido a la sobreestimación del efecto inhibitorio del pH, resultó ser una herramienta útil para identificar riesgos en productos vegetales. En el Capítulo II, se investigó el riesgo de contaminación cruzada durante el lavado de hortalizas de hoja, con especial enfoque en las células en estado viable pero no cultivable (VBNC) de Listeria monocytogenes y Escherichia coli O157:H7 presentes en el agua. Este estado puede ser inducido por desinfectantes utilizados en la industria hortofrutícola para mantener la calidad microbiológica del agua. Además, se evaluó su capacidad para resucitar al estado cultivable durante la vida útil del producto. Los resultados demostraron por primera vez que las células VBNC de L. monocytogenes podían adherirse a las hortalizas durante el lavado industrial y resucitar al estado cultivable durante la conservación (15 días a 7ºC). Por el contrario, no se observaron estos fenómenos en los ensayos con E. coli O157:H7. Este hallazgo subraya la importancia de controlar las células VBNC de L. monocytogenes en la industria de vegetales frescos. En el Capítulo III se evaluaron estrategias de control post-proceso, comparando la eficacia de cuatro tratamientos comerciales para controlar la proliferación de L. monocytogenes en hortalizas de hoja. Se analizaron dos tratamientos basados en bacteriófagos (PhageGuard Listex y ListShield) y dos en cultivos protectores (SafePro y HOLDBAC). PhageGuard Listex fue el tratamiento más efectivo en los productos tratados (lechugas romana e iceberg, espinaca baby y col), reduciendo significativamente el crecimiento de L. monocytogenes en lechuga romana e iceberg en comparación con los controles no tratados, sin afectar la calidad organoléptica de los productos. En el capítulo IV, se validó el uso de PhageGuard Listex en plantas de procesado de frutas y hortalizas frescas en España y Dinamarca. El tratamiento se aplicó mediante nebulización, logrando la concentración objetivo de bacteriófagos en el producto en tres de las cuatro pruebas. Aunque no se evaluó su eficacia directa contra L. monocytogenes debido a la no detección de contaminación natural en el producto tratado, el estudio demostró la viabilidad de la aplicación industrial de esta estrategia sin efectos negativos en la calidad del producto. En conclusión, esta tesis contribuye a una mejor comprensión del riesgo que representa L. monocytogenes en hortalizas frescas y propone estrategias efectivas para su control, cumpliendo con los estándares regulatorios y las expectativas del mercado.

Listeria monocytogenes is a bacterium that poses a significant risk to food safety, particularly in ready-to-eat products like fresh produce. Its remarkable ability to adapt and survive under adverse environmental conditions makes it a persistent threat in food processing environments. The contamination of horticultural products during pre- and post-harvest operations presents a serious public health risk, as it can lead to listeriosis, a severe infection, particularly dangerous for vulnerable populations. The objective of this thesis was to investigate the factors influencing the growth of L. monocytogenes in fresh produce and to develop effective strategies for controlling this pathogen in the fruit and vegetable processing industry. Additionally, various post-process interventions were assessed to reduce the proliferation of this bacterium during the shelf life of fresh produce. The research was structured into four experimental studies, outlined in Chapters I-IV. In Chapter I, a secondary model (gamma model) was applied to evaluate the behavior of L. monocytogenes in plant-based products, considering inhibitory factors such as pH, water activity (aw), and storage temperature. This model was validated using data from 105 scientific studies, achieving a concordance of 83.2% for vegetables and 87.5% for leafy vegetables, a group identified as more susceptible to L. monocytogenes growth. Although the model had limitations with fruits, due to overestimating the inhibitory effect of pH, it proved useful in identifying risks associated with fresh produce. In Chapter II, the risk of cross-contamination during the washing of leafy vegetables was investigated, focusing on viable but non-culturable (VBNC) cells of L. monocytogenes and E. coli O157 induced by disinfectants commonly used in the industry to maintain water quality. The ability of these cells to return to a culturable state during the product’s shelf life was also evaluated. For the first time, the study demonstrated that VBNC cells of L. monocytogenes could adhere to leafy greens during industrial washing and resuscitate to a culturable state during storage (15 days at 7°C). In contrast, these phenomena were not observed in E. coli O157 trials, underscoring the importance of controlling L. monocytogenes VBNC cells in fresh produce. Chapter III evaluated post-process control strategies by comparing the effectiveness of four commercial treatments in managing the proliferation of L. monocytogenes in leafy vegetables. Two treatments based on bacteriophages (PhageGuard Listex and ListShield) and two based on bacteriocin-producing protective cultures (SafePro and HOLDBAC) were analyzed. PhageGuard Listex was the most effective treatment for the tested products (romaine and iceberg lettuce, baby spinach, and cabbage), significantly reducing L. monocytogenes growth in romaine and iceberg lettuce compared to untreated controls, without negatively impacting the organoleptic qualities of the products. In Chapter IV, the industrial application of PhageGuard Listex was validated in fresh produce processing plants in Spain and Denmark. The treatment was applied via a nebulization device, successfully reaching the target bacteriophage concentration in shredded lettuce in three out of four trials. Although the effectiveness of PhageGuard Listex against L. monocytogenes could not be directly assessed due to the absence of natural contamination in the treated samples, the study demonstrated the feasibility of industrial application without compromising product quality. In conclusion, this thesis contributes significantly to understanding and managing the risks associated with L. monocytogenes in the fresh produce industry. The control strategies evaluated, particularly the use of PhageGuard Listex, show great promise in enhancing the microbiological safety of leafy greens while maintaining product quality, meeting both regulatory standards and market demands.